Общая и частная гистология

1.7. Заключение и этикетирование (маркировка) препаратов

После заключения среза в бальзам и под предметное стекло, т. е. после приготовления так называемого постоянного препарата, он подлежит обозначению – маркировке. Для этого справа и слева от покровного стекла наклеивают этикетки с надписями: слева – описание ткани или органа, объекта, из которого получен материал, справа – метод окрашивания; в необходимых случаях указывают фиксацию материала и дату изготовления препарата.

1.8. Микроскоп и правила работы с ним

Микроскоп – сложный и самый распространенный в биологии и медицине прибор для изучения мелких органов, клеток и тканей организма (рис. 1.3). Наиболее важное значение в нем имеют объективы. Они находятся в непосредственной близости от рассматриваемого объекта, отчего и получили свое название. Объектив состоит из ряда линз, закрепленных в оправе с международной стандартной резьбой в 36 витков в тубусе микроскопа любой оптической фирмы.

Увеличение микроскопа равно произведению цифровых значений объектива и окуляра, скоординированных на тубусе микроскопа, т. е. поставленных друг против друга.

Цена увеличения нанесена на обойме объектива и в верхней линзовой плашке окуляра [в рабочих студенческих микроскопах значения таковы: объектив ?8, ?40, ?90 (иммерсионный); окуляр ?7, ?10].

Общее увеличение светооптического микроскопа равно 2000–2500, однако полезное увеличение, способствующее выявлению деталей объекта, составляет 1500–1600.

Изображение, полученное от простой сферической линзы, направленной непосредственно на рассматриваемый объект, имеет два недостатка: сферическую и хроматическую аберрации, суть которых заключается в следующем.

Известно, что в двояковыпуклой линзе лучи, более удаленные от центра, т. е. центральной оптической оси, сильнее преломляются и пересекают главную оптическую ось на сравнительно близких расстояниях от центра линзы. Лучи, расположенные недалеко от оси, будут преломляться меньше и отдаляются от центра линзы. Таким образом, вместо стигматического точечного изображения возникает расплывчатое пятно. Такая погрешность оптической линзы получила название сферической аберрации.

Рис. 1.3. Световой микроскоп.

1 – окуляр; 2 – объектив; 3 – предметный столик; 4 – источник света.

Количественно сферическая аберрация характеризуется продольной аберрацией – линейным расстоянием между точками пересечения крайних и центральных лучей с главной оптической осью.

Продольные аберрации обусловлены материалом линзы и ее кривизной. В последнем случае аберрации собирательной и рассеивающей линз противоположны по знаку, что позволяет, комбинируя такие линзы в объективе, уменьшить сферическую аберрацию. Это в микроскопах достигается путем набора линз разной значимости в одном объективе.

Кроме сферической, существует хроматическая аберрация, связанная с тем, что волны различной длины преломляются неодинаково: фиолетовые сильнее, красные меньше всего. В результате этого белое пятно будет цветным, окрашенным во все цвета спектра на усредненном экране. Такая наслойка дополнительного цвета на окрашенные гистологические препараты нежелательна и должна быть сведена до минимума. Это достигается комбинацией линз из стекла специального состава. Такая система называется ахроматической и в простом варианте состоит из выпуклой линзы, изготовленной из кронгласа (легкий сорт стекла), склеенной с двояковыпуклой линзой из флинтгласса (тяжелый сорт стекла).

Все объективы микроскопа делятся на ахроматы, в которых устранена аберрация двух наиболее ярких цветов спектра – желтого и зеленого, апохроматы, в которых хроматическая аберрация устранена почти полностью, и полуахроматы; так называемые флюоритовые, занимающие среднее положение между названными объективами.

Для исследования мелких деталей, особенно при цитологических наблюдениях, используют иммерсионные объективы с высокой разрешающей силой.

Чтобы усилить освещенность, в таких системах применяют жидкости, уменьшающие рассеивание света (водная и масляная иммерсия) и заполняющие пространство между верхней поверхностью покровного стекла и передней линзой объектива.

Использование иммерсионного масла, имеющего одинаковый со стеклом и канадским бальзамом коэффициент преломления, создает идеальную гомогенную среду, обеспечивающую возможность различать мельчайшие детали клеток и тканей.

Разрешающей способностью называется способность объектива «разрешить», т. е. показать, наименьшее расстояние между двумя близлежащими деталями предмета, при котором они еще видны раздельно. Она выражается формулой

, где ? – длина световой волны, А – числовая апертура.

Числовая апертура – произведение показателя преломления среды, находящейся между предметом и объективом, и синуса половины угла, образованного двумя крайними лучами, которые еще проходят объектив. Формула ее такова: А = n · sin а, где n – коэффициент преломления среды, ? – значение угла. В цифровом выражении показатель А выгравирован на обойме каждого объектива ниже знака линейного увеличения более мелким шрифтом. Таким образом, исследователь освобожден от необходимости вычисления апертуры по приведенной формуле. При подборе объективов для практических целей необходимо всегда обращать внимание на этот показатель: чем больше числовая апертура, тем выше разрешающая способность объектива, следовательно, и всего микроскопа как прибора, так как окуляр на значение разрешающей силы не влияет, что видно из ранее приведенных формул. Теоретически разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм, практически оно обычно равно 0,4 мкм.

Приступая к микроскопированию гистологических препаратов, необходимо помнить следующее: всякое исследование надо начинать при малом увеличении для ознакомления с общим видом препарата, расположением тканевых структур различного характера, особенностями их окраски, сочетанием комплексов клеточных структур в различных слоях органа.

При рассеянном искусственном и естественном освещении пользуются вогнутым зеркалом, при точечном источнике света – плоской его поверхностью, регулируя конденсором, особенно при работе с иммерсионными объективами, степень освещенности поля зрения.

Перед переходом на большое увеличение нужную деталь, подлежащую изучению, надо установить при малом увеличении в центре зрения и, не поднимая тубуса микроскопа макрометрическим винтом, плавным движением перевести револьвер на большое увеличение; дальнейшую юстировку (отработка четкости изображения) надо проводить с помощью только микрометрического винта.

Микроскоп нужно содержать в чистоте, после работы вытирать от пыли фланелевой или марлевой салфеткой и предохранять от механических повреждений, не оставлять в местах солнечного освещения или теплового прогревания.

По окончании работы необходимо перевести револьвер микроскопа на малое увеличение, снять с предметного столика препарат, очистить от пыли и грязи сначала оптические, а затем механические части и сдать лаборанту свое рабочее место и все, что было принято перед лабораторной работой.

Глава 2

Строение клетки

Клетка (cellula) – наименьшая структурная единица живого, способная к независимому существованию. Она является основой развития, строения и жизнедеятельности всех животных и растительных организмов.

Главные функции клетки: возбудимость, проводимость, сократимость, поглощение и ассимиляция, дыхание, секреция, экскреция, рост и репродукция.

Клетка состоит из трех основных частей: ядра, цитоплазмы и плазматической мембраны (цитолемма).

Ядро(nucleus) – система генетической детерминации и регуляции белкового синтеза в клетке (рис. 2.1).

Структурные компоненты ядра: хроматин (хромосомы), ядерная оболочка (кариолемма), ядрышко, нуклеоплазма (ядерный сок).

Рис. 2.1. Фибробласт. Ядро. ТЭМ. ?22 000.

1 – ядро; 2 – гетерохроматин; 3 – эухроматин; 4 – ядерное тельце; 5 – кариолемма; 6 – комплекс Гольджи; 7 – митохондрии; 8 – лизосомы; 9 – цистерны гранулярной ЭПС.

Функции ядра: воспроизведение, накопление, хранение и распределение генетического материала (содержит 23 пары ДНК хромосом); регуляция синтеза белка в цитоплазме посредством макромолекул рибосомной РНК (рРНК), информационной РНК (иРНК) и транспортной РНК (тРНК).

Различают эухроматин (слабоокрашиваемый, диспергированный, менее конденсированный, активно участвует в процессах транскрипции), соответствует сегментам хромосом, которые деспирализованы и открыты для транскрипции, и гетерохроматин (хорошо окрашиваемый, конденсированный, не постоянно участвует в процессах транскрипции), соответствующий конденсированным, плотно скрученным сегментам хромосом.

Тельце Бара – скопление гетерохроматина, соответствующее неактивной Х-хромосоме у особей женского пола.

Организация хромосом сложная. Они состоят из спиралей, которые сформированы из гистоновых нуклеосом, образующих сердечники, вокруг которых обернута двойная спираль ДНК.

Молекула ДНК построена из двух антипараллельных цепей с комплементарной последовательностью нуклеотидов. Участок молекулы ДНК, кодирующий последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, называется геномом.

Ядерная оболочка (nucleolemma) состоит из наружной и внутренней параллельных мембран, разделенных узким перинуклеарным пространством – цистерной, диаметром 10–30 нм. Мембраны продолжаются друг в друга вокруг ядерных пор.

К наружной ядерной мембране прикреплены рибосомы. Наружная мембрана переходит в гранулярную эндоплазматическую сеть (ГЭПС).

Внутренняя ядерная мембрана содержит сеть переплетающихся промежуточных (виментиновых) филаментов, связанных с ядерной пластинкой, к которой прикрепляются интерфазные хромосомы. Ядерная пластинка состоит из переплетенных промежуточных филаментов (ламинов) толщиной 80—100 нм, образующих кариоскелет.

Ядерные поры – это каналы связи диаметром 70—100 нм между ядром и цитоплазмой, их число и распределение изменчивы. Двусторонний транспорт через пору обеспечивается белками экспортинами (транспортируют РНК из ядра) и импортинами (переносят белковые субъединицы рибосом).

Ядерная пора изнутри выстлана специализированными структурами, образующими комплекс ядерной поры.

Комплекс ядерной поры (КЯП) состоит из немембранных структур: белка-рецептора на сигналы ядерного импорта, а также крупных белковых гранул, определяющих границы поры.

Пора ограничена восемью вертикальными белковыми комплексами, которые представляют собой крупные белковые молекулы или компоненты рибосом, находящиеся в процессе транспорта. По горизонтали пора ограничена тремя кольцевидными структурами, располагающимися одна над другой и соединенными вертикально 8 «спицами». Пора содержит также цитоплазменные волокна, транспортер и ядерную корзинку.

Первое кольцо со стороны цитоплазмы имеет волокнистую структуру – специализированный связывающий белок, который тянется в цитоплазму и обеспечивает импорт в ядро различных субстратов.

Среднее кольцо состоит из восьми трансмембранных белковых молекул, которые выбухают и в просвет поры, и в перинуклеарную цистерну. Эти молекулы прикрепляют гликопротеиновые компоненты КЯП к наружному ободку поры. Центр среднего кольца занят «транспортером», прикрепленным к периферическим белкам среднего кольца.

Третье кольцо со стороны нуклеоплазмы аналогично по строению первому. От него в сторону нуклеоплазмы отходит ядерная корзина, которая деформируется при транспорте веществ через пору.