Секретные результаты опытов клонирования. Сколько их среди нас?

В настоящее время партеногенез можно рассматривать как стимулируемую способность к развитию любых живых систем, независимо от того, связана ли данная способность с осеменением.

История партеногенеза

Термин «партеногенез» был введен в 1849 г. известным зоологом Ричардом Оуэном. Под партеногенезом Оуэн понимал способность части клеточного потомства первичной оплодотворенной зародышевой клетки (яйца) сохранять достаточную силу для воспроизведения индивидуумов при отсутствии повторения акта оплодотворения. Под это определение подпадало возобновление листьев из почек, явления регенерации (например, восстановление хвоста у ящерицы), а также все варианты бесполого размножения.

Еще до появления термина «партеногенез» в 1737 г. французские естествоиспытатели Реомюр и Бонэ выявили и доказали способность тли к бесполому размножению. В данном случае развитие происходило без участия особей мужского пола. Однако в течение 100 лет после этого открытия ведущей была точка зрения Трамбле, который считал, что в случае девственного размножения осеменение все же однажды произошло. По его мнению, случившегося спаривания было достаточно на несколько поколений вперед. В 1839 г. было доказано, что у живородящей тли, в отличие от яйцекладущих, отсутствует семяприемник. Что касается Реомюра и Бонэ, то они относили данное явление к гермафродитизму без спаривания.

Исследователи рассматривали живородящую тлю как бесполую стадию, обладающую способностью к размножению путем внутреннего зародышеобразования, подобно почкованию у растений. Чтобы подчеркнуть предположительное развитие не из яйца, яичники тли называли зародышниками и утверждали чередование в их жизненном цикле полового и бесполого размножения.

Основная заслуга в определении партеногенеза принадлежит Теодору Эрнсту фон Зибольду. о партеногенезе он писал следующее: «Я понимаю под партеногенезом не размножение посредством кормилицеподобных и личиночных существ, но размножение через действительных самок, то есть особей, обладающих функционирующими женскими половыми органами и могущих без предшествующего спаривания производить неоплодотворенные, способные к развитию яйца». После этого бесполое размножение, чередование поколений и регенерация перестали входить в число явлений, определенных как партеногенез Оуэном.

Следует отметить, что в определении Зибольда говорится о способных к развитию неоплодотворенных яйцах, что предполагает их стимуляцию к развитию каким-либо агентом и побуждает исследователей к поиску универсальных механизмов данной способности к развитию методами экспериментальной биологии. Поиски привели к развитию искусственного партеногенеза сначала у тутового шелко-пряда, а позже у других животных.

В течение долгого времени ученые, занимающиеся тутовым шелкопрядом, не раз сталкивались с вылуплением личинок из яиц, отложенных заведомо неосемененными самками. Следует отметить, что данные наблюдения никогда не принимались во внимание учеными, работавшими с тутовым шелкопрядом. Дело в том, что это явление было настолько редким, что проще было предположить погрешности в наблюдении.

Профессионалы до середины прошлого века проводили объемные исследования разных пород, рас и линий, что позволило сделать вывод о том, что партеногенетическое развитие яиц без видимых причин (спонтанное развитие) происходит крайне редко. В данном случае имеется в виду полное развитие, завершающееся вылуплением личинки (под полным развитием понимается развитие до стадии репродуктивно полноценной бабочки). Если принимать во внимание данное утверждение, частота полного партеногенеза снизится примерно в 2 раза.

У моновольтных шелковичных червей цвет развивающихся яиц уже через сутки начинает изменяться с желтого на розовый, а затем темно-серый. Такая окраска яиц характерна для диапаузы. Для возобновления развития в следующем году яйцам необходимо пройти охлаждение при температуре домашнего холодильника в течение 4 и более месяцев. Изменение окраски объясняется тем, что в ходе развития зародыша под поверхностью яйца образуется однослойная серозная оболочка. Ее клетки постепенно заполняются гранулами пигмента меланина, которые все больше закрывают наполняющий яйцо желток.

Если учитывать величину кладки и процент имеющихся в ней пигментированных яиц, можно с достаточной точностью оценить качество большого количества кладок. Благодаря этому можно отобрать самые лучшие кладки, в которых только единичные яйца по каким-либо причинам не развиваются и остаются желтыми.

Учеными было замечено, что самки, оставленные без самцов, плохо откладывают неосемененную грену. Данный процесс, как правило, растягивается на неделю и более, часть яиц обнаруживается в овариолах погибших бабочек.

Частичная пигментация яиц, не соответствующая норме, не могла остаться незамеченной в течение многих веков. Следует отметить, что такая пигментация приближается к нормальной крайне редко. Именно из таких яиц могут появиться личинки с указанной выше частотой.

Таким образом, любая степень пигментации яйца тутового шелкопряда является признаком начавшегося развития, даже если причины, вызвавшие его, остаются неизвестными. Данный вывод использовал в своих опытах с шелковичными червями в 1886 г. русский зоолог А. А. Тихомиров. Именно он открыл у животных искусственный партеногенез, то есть развитие неоплодотворенного яйца под воздействием искусственного раздражителя.

В своих опытах ученый доказал активирующее действие на неоплодотворенные яйца сильной серной кислоты, электризации посредством трения и горячей воды. Следует отметить, что найденные Тихомировым активаторы во многих случаях существенно повышали процент пигментированных яиц в обработанных пробах. Однако пигментация в большинстве случаев была неполноценной и имела отклонения от нормы. Это соответствовало уродливому развитию зародыша внутри яйца и отсутствию вылупившихся гусениц в обработанной грене.

Заключение Тихомирова сводилось к тому, что практическое применение искусственного партеногенеза не представляется возможным. Само явление он объяснял тем, что искусственный раздражитель заменяет собой раздражение, которое вызывает сперматозоид после проникновения в яйцо. Согласно теории Тихомирова, искусственный партеногенез представляет собой проявление раздражимости – внутреннего свойства всего живого.

Мы уже говорили о двойной функции сперматозоида в процессе оплодотворения. Четкое представление об этой функции было и у Тихомирова, поэтому уродливое развитие искусственно активированного яйца без материала сперматозоида не было для него удивительным. Оно, напротив, подчеркивало необходимость материала мужской гаметы для развития яйца и делало работу с искусственными раздражителями бесперспективной.

Если активирующие агенты способствуют увеличению процента развивающихся яиц по сравнению с контролем, чем же тогда вызвана их активация в самом контроле? Скорее всего, в данном случае играют роль какие-либо неизвестные внешние факторы. Эта точка зрения согласуется с мнением Тихомирова о влиянии на способность яиц к партеногенетическому развитию. Она соответствует и мнению других исследователей о влиянии условий среды, сезона выкормки, качества скармливаемого гусеницам листа шелковицы на уровень спонтанного партеногенеза.

Тихомиров выявил методический прием, который определил успех всех последующих исследований, связанных с партеногенезом тутового шелкопряда. С целью последующей обработки он извлек зрелые яйца из яйцевых трубок девственных бабочек. Таким образом ученый решил 2 проблемы. Во-первых, отпала необходимость ждать, пока неосемененные самки отложат необходимое для опытов количество неоплодотворенной грены. Кроме того, пробы синхронизированных яиц можно отбирать подходящей меркой. Во-вторых, ликвидировались внешние факторы, оказывающие воздействие на яйцо при откладке. Появилась возможность контролировать саму процедуру извлечения.

В 1903 г. Тихомиров прекратил опыты по искусственному партеногенезу. К тому времени они уже широко проводились на других животных объектах, в частности на морских беспозвоночных. Открытие искусственного партеногенеза дало исследователям возможность предположить, что может быть найден способ замены живого сперматозоида хорошо известными физико-химическими факторами.

Это помогло бы выяснить причины, вызывающие развитие яйца при условии его естественного взаимодействия со спермием.

Данный вид взаимодействия приводит в первую очередь к активации яйца. Этот процесс более доступен для наблюдения у морских беспозвоночных, чем на яйцах тутового шелкопряда. По этой причине исследования механизмов естественной и искусственной активации яйца были перенесены с тутового шелкопряда на морского ежа, а затем на земноводных и млекопитающих.

Впоследствии сторонниками физико-химического направления проводились опыты по поиску заменителей действия сперматозоида на яйцо. Например, Жак Леб полагал, что причиной деления клеток является несоответствие между запасными веществами цитоплазмы и хроматиновым веществом ядра. Действие сперматозоида заключается в запуске и ускорении синтеза хроматина ядра из веществ цитоплазмы. Положительный катализатор, привносимый спермием в яйцо, не был обнаружен, поэтому ученые предположили возможность наличия отрицательного катализатора в самом яйце. Этот блок устраняется сперматозоидом в процессе оплодотворения. При естественном партеногенезе этот блок отсутствует, а при искусственном нейтрализуется в результате действия подобранного агента.

Леб постепенно усложнил процедуру активации яиц морского ежа и вывел двухступенчатый метод искусственного партеногенеза. Первый этап состоял в выделении оболочки оплодотворения под действием цитологического агента, в качестве которого использовалась валериановая или масляная кислота. После этого начавшееся развитие доводили до нормы путем непродолжительного действия гипертонического раствора морской соли, вызывающего образование дополнительного центриолярного аппарата (астросферы). Это необходимо для нормального деления яйцеклетки. Используя данный метод, Леб получил большое количество партеногенетических личинок и пришел к выводу, что метод воспроизводит действие сперматозоида.

По мнению Леба, сперматозоид вносит в яйцо как литический, так и корректирующий фактор. Однако нередко результаты исследований не соответствовали представлениям ученого. Помимо этого, литические и корректирующие явления внутри яйца не подлежали толкованию в физико-химических понятиях.

Ученые считали, что основой деления клеток является процесс периодического желатинирования и разжижения цитоплазмы. На этом основании исследователь партеногенеза Ив Деляж решил запустить развитие яйца, вызвав данные изменения искусственным путем, и добился положительных результатов при использовании в качестве раздражающих агентов таннина и аммиака. В результате эксперимента практически все яйца начали развиваться, многие достигли стадии личинки, а некоторые и взрослого состояния.

Известный исследователь процесса оплодотворения Лили полагал, что опыты Деляжа основаны не на теории активации, так как процессы, лежащие в основе явления, только сопровождают активацию, но не являются ее причиной. О теории активации действительно говорить не приходилось, а свойство механизма активации – освобождение от блокирования под действием чередующихся обработок танином и аммиаком – имело место.

Взрослые партеногенетические особи могли быть получены у амфибий путем травматического партеногенеза, при котором яйцо укалывали иглой. Этот метод, открытый Ю. Батайоном, успешно используется и в настоящее время. Автор метода считал, что активация в данном случае состоит из двух этапов. Сначала с помощью укола вызывается сокращение оболочки яйца, что приводит к выделению из него вместе с жидкостью веществ, блокирующих развитие. Затем из клеточных фрагментов, вносимых в цитоплазму в области укола, образуется центриолярный аппарат, осуществляющий первое деление дробления.

Немецкий биолог Теодор Бовери полагал, что активация в данном случае обусловлена тем, что сперматозоид привносит в яйцо необходимый клеточный орган – центросому. Что касается травматического партеногенеза, он может быть рассмотрен как подтверждение центросомной теории Бовери, однако в других случаях партеногенеза привнесение центросомы извне не имеет места. Поэтому считается, что партеногенез доказывает ошибочность теории Бовери.

С течением времени исследования процессов активации ядра распространились и на другие более высокоорганизованные объекты и приобрели характер качественного анализа. Например, на яйцах морской звезды было доказано, что образование оболочки оплодотворения и развитие личинки происходят в различной степени в соответствии с дозой и схемой приложения температурного воздействия. Исследователи заключили, что процесс активации яйца с помощью прогревания зависит от определенного критического изменения в яйце, начинающегося при температуре 29 °C. Данное изменение, ускоряющееся при более высокой температуре, может быть вызвано как разовым, так и множественным приложением температурной дозы.

Часть дозы может быть заменена воздействием других агентов, например слабых кислот. Процесс активации с помощью прогревания изучался в соответствии со степенью зрелости яйца, содержанием в нем кислорода и цианидов. Ученые заключили, что основой активирующего компонента является образование кислоты внутри яйца.

Рядом исследований было доказано, что неидентифицированная кислота образуется в яйце в процессе оплодотворения и при воздействии активаторов искусственного партеногенеза или при хранении в анаэробных условиях. Исследования в области искусственной активации морских беспозвоночных привели к установлению важной роли кальция в активационных процессах. В процессе активации кальций имеет значение как вне яйца, так и внутри него.

Позднее, опираясь на накопленные данные, Пастельс предположил теорию активации, основанную на центральной роли кальция. Согласно данной теории, активация заключается либо в увеличении проницаемости яйца для ионов кальция, либо в изменении равновесия свободного и связанного кальция внутри яйца. После этого Л. Гейльбруном была представлена теория реактивности клетки. Ученый предполагал, что реактивность клетки и активация яйца объясняются переходом кальция из кортекса, где он был связан с протеиновым гелем, внутрь клетки под воздействием различных активаторов, включая сперматозоид, в случае с яйцеклеткой. В результате перемещения кальция происходит уменьшение плотности кортикального слоя (разжижение) и желатинизация нужного слоя ооплазмы. Описанный процесс является важнейшей характеристикой активации.

Доктор Панайотис Завос сообщил о том, что готов вырастить ребенка из замороженного десятиклеточного клонированного эмбриона. Как сообщили источники СМИ, через несколько недель будет проведена имплантация эмбриона суррогатной матери. Для создания клона была использована ДНК 46-летней американки. Манипуляции будет позволено снимать британскому кинематографисту Питеру Уильямсу, который в 1978 г. зафиксировал весь процесс создания первого ребенка «из пробирки».

Было также показано, что лишенное кортекса яйцо не способно к оплодотворению. После этого на внутренней границе кортикального слоя были обнаружены расположенные в виде монослоя кортикальные гранулы. В процессе оплодотворения эти гранулы исчезают за 15–20 секунд. Этот процесс начинается в точке вхождения спермия в яйцо и распространяется под поверхностью яйца. Кортикальную реакцию вызывают следующие партеногенетические агенты: сапонин, толуол, ультрафиолет, укалывание, электрическое воздействие и т. д. Однако перечисленные агенты действуют лишь при условии, что яйцо не было обработано оксалатом и цитратом, связывающими кальций.