Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

– этанол 96 %-й (III) – 3 – 5 ч (при комнатной температуре).

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 6 – 18 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 2 – 4 ч (при температуре 37 °C).

Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола соответствующей крепости. Поэтому качество спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98 %. Объем обезвоживающего раствора должен не менее чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов. Абсолютный этанол можно заменить абсолютированным изопропанолом (99 %). Пригодна для этого и смесь абсолютированного изопропанола и этанола 96 %-го (1: 1).

3.2. Заливка объектов в парафин

Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.

Парафин – смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 – 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).

Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1 – 2 °C выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58 °C).

Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат, если он был использован для длительного хранения объектов) при помощи промежуточной среды – растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве промежуточной среды можно использовать хлороформ, авиационный бензин (рекомендован Р. Лилли, 1969), петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ и ксилол. Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа «для спектроскопии», в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, долго хранившегося на свету. При доступности абсолютного этанола следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.

Можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки и пропитывания материала.

Заливка в парафин с использованием хлороформа. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– смесь абсолютного этанола с хлороформом 1: 1 – 1 – 2 ч;

– хлороформ (I) – 1 ч;

– хлороформ (II) – 1 ч;

– хлороформ (III) – 1 ч;

– хлороформ – парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – 12 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин;

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 40 – 60 мин.

При отсутствии возможности использовать абсолютный этанол первый этап проводки можно пропустить, однако качество пропитки парафином может быть несколько хуже. После обезвоживания с использованием метилсалицилата (или метилбензоата) этот этап следует пропустить. Качество заливки при этом не ухудшится.

Заливка в парафин с использованием петролейного эфира. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– петролейный эфир (I) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (II) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир (III) – 30 – 60 мин;

– петролейный эфир-парафин (1:1) в термостате при 37 °C – 3 – 24 ч;

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 60 мин.

Схема проводки материала и заливки в парафин после фиксации объектов в жидкости Буэна, применяемая в отделе общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН.

Перед фиксацией мелкие, тонкие и легко деформирующиеся объекты необходимо поместить на кусочек плотной бумаги. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:

– жидкость Буэна для фиксации – 1 сут;

– короткая промывка в водопроводной воде – 1 – 15 мин;

– этанол 70 %-й – 1 сут;

– этанол 80 %-й – 1 – 7 сут;

– этанол 90 %-й – 1 сут;

– этанол 96 %-й – 1 сут;

– абсолютный этанол – 1 сут;

– абсолютный этанол-хлороформ 1: 1 – 2 – 3 ч;

– хлороформ (I) – 90 мин;

– хлороформ (II) – 90 мин;

– хлороформ-парафин (1: 1) в термостате при 37 °C – оставить на ночь (10 – 15 ч);

– парафин (I) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (II) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч;

– парафин (III) в термостате при 56 – 58 °C – 1 ч.

Автоматизация процесса замещения промежуточных сред на парафин достигается использованием вакуумных процессоров (например, VIP 6, Sakura), в которых не только происходит автоматическая смена и перемешивание реактивов, но и создаются специальные условия для лучшей пропитки тканей реагентами.

По окончании проводки осуществляется заливка. Объект помещают в бумажную или подогретую в термостате специальную пластиковую (из полипропилена, полистирола и т. п.) или металлическую формочку. Далее в нее наливают свежую порцию разогретого до 58 – 65 °C парафина. Разогрев заливочного парафина свыше 56 °C рекомендуется в связи с возможностью быстрого застывания парафина, вынутого из термостата, что приводит к неравномерной заливке блока с сохранением пустот. В случае необходимости особой ориентации кусочка ткани при изготовлении срезов можно повернуть материал, обратив плоскость резки ко дну формочки, с помощью подогретых препаровальной иглы и глазного пинцета.