Доклады МОИП. Секция Геронтологии. Том 67

На рисунке 4 показаны различные варианты воздействия антиоксидантов на кривые выживания:

Рис.4. Типы изменения кривых выживаемости при действии геропротекторов.

I – Равномерное замедление старения: равное увеличение средней и максимальной

продолжительности жизни (ПЖ).

II – Замедление старение с большой лаг-фазой: большее увеличение максимальной ПЖ.

III – Улучшение условий жизни: увеличение только средней ПЖ, а не максимальной ПЖ.

Вещества, которые замедляли старение (I и II вариант), стали называть геропротекторами.

Необходимым условием доказательства, что данное препарат действительно геропротектор, стало достоверное уменьшение смертности под его влиянием во всех возрастных группах экспериментальных животных. При этом условии не возникает вопрос о продлении жизни одних особей популяции за счёт укорочении жизни других. Особое значение приобрели работы, в которых установлен не только факт увеличения средней продолжительности жизни (СПЖ), но и максимальной продолжительности жизни (МПЖ). Изменение только СПЖ может быть связано не с процессом старения экспериментальных животных, а с изменением условий их жизни. Только после того, как установлен факт увеличения продолжительности жизни экспериментальных животных, серьезное значение приобретает изучение особенностей влияния этого вещества на отдельные системы организма. Легкость, с которой открывали все новые антиоксиданты-геропротекторы и свободно-радикальные патологии, создала бум вокруг антиоксидантов-геропротекторов.

Работы Хармана были процитированы более 5500 раз. В результате были поставлены проверочные, хорошо обставленные исследования на большой выборке (до 250 000 человек), которые показали, что антиоксидантные витамины в некоторых комбинациях не оказывают ожидаемого положительного влияния на продолжительность жизни человека, а в отдельных вариантах оказывают отрицательное действие. До сих пор эти работы широко цитируются в научной и популярной геронтологической литературе, хотя были опубликованы многочисленные разъяснения этих отрицательных эффектов антиоксидантных витаминов.

Уместно вспомнить, что научной теории, чтобы развиться, просто необходимы общественные проклятия, ненависть научной среды и осмеяние в прессе. Именно эти факторы обычно мобилизуют и вооружают серьезные идеи, провоцируют их на движение и победы [67]. Очевидно, что эти эксперименты ярко продемонстрировали, что иллюзия легкости обращения со свободно-радикальной тематикой возникла от недостаточности знаний в этой области, что свободно-радикальная теория еще нуждается в доработке и дальнейшем развитии. Т.е. возникла необходимость развития свободно-радикальной теории старения, которую мы решили назвать в новом варианте «антиоксидантная концепция старения». Что с самого начала во главу ставит не повреждение, а защиту от агрессоров. Следует подчеркнуть наиболее важные моменты:

– исправление ошибок интерпретации и логических несоответствий критических нападок противников антиоксидантов;

– связь свободно-радикальных механизмов старения с возрастным увеличением смертности от главных пато-геронтологических процессов (болезней системы кровообращения и злокачественных новообразований);

– стремление к пониманию старения именно человека. Так как механизмы старения человека часто отличаются от механизмов старения мышей и дрозофил.

С целью дальнейшего развития начатых работ в 1975 году на Секции химико-технологических и биологических наук АН СССР была сформирована комиссия по проблемам «Искусственного увеличения видовой продолжительности жизни людей». Председателем комиссии назначен академик Н. М. Эмануэль, его заместителем – Л. В. Комаров. Был составлен координационный план научных исследований по проблеме «Искусственное увеличение видовой продолжительности жизни людей» на 1976—1985 гг.

План охватывал свыше 50 тем, среди них такие, как «Эволюционные предпосылки возникновения генетической программы старения человека», «Роль наследственных факторов в собственно старческих и компенсаторно-старческих изменениях организма», «Биологические и социальные факторы долгожительства», «Изучение роли репартивных механизмов клетки» [71].

В 1975 году в Институте химической физики АН СССР была организована лаборатория «Количественной геронтологии» (первая геронтологическая лаборатория в АН СССР), которая развернула научную работу в сотрудничестве с Центральной клинической больницей УД АН СССР (заведующий Т. Л. Наджарян, совмещающий заведование отделением реанимации ЦКБ УД СССР, и его заместитель В. Б. Мамаев).

С самого начала в основу наших исследований был положен количественный подход в отличии от Киевского института геронтологии МЗ СССР. Мы основной акцент в нашей работе делали на математическое описание реальных процессов, которые можно объективно установить без теоретических предположений и допущений. Кроме того под руководством академика Н. М. Эмануэля и его заместителем Т. Л. Наджаряна начал свою работу московский научный семинар «Фундаментальные проблемы биологии старения», материалы которого были опубликованы в трех сборниках «Итоги науки и техники ВИНИТИ» [51, 7, 8].

«Кому нужны старые мыши?»

С этим вопросом или утверждением Н.М. открывал совместную работу лаборатории количественной геронтологии с Центральной клинической больницей УД АН СССР.

Первый подход к замедлению старение человека исследовать репликативное старение клеток человека в культуре.

И следующим этапом развития было изучение влияния антиоксидантов-геропротекторов на клетки человека, что возможно только в условиях in vitro. К этому времени были три группы работ, которые указывали на возможность такого влияния.

Во-первых, было показано [76, 89] влияние парциального давления кислорода на рост, метаболизм и клеточный цикл диплоидных клеток человека в культуре. В клеточном цикле существуют периоды, чувствительные к повышению концентрации кислорода и супероксидных радикалов. При повышении концентрации кислорода деление нормальных клеток подавлялось [88, 96].

Во-вторых, при нормальном парциальном давлении кислорода введение в культуральную среду антиоксидантов, наоборот, стимулировало деление клеток [2].

В-третьих, при сопоставлении продолжительности жизни клеток в кровяном русле c активностью СОД [57, 58], уровнем генерации супер-оксидных радикалов в гранулоцитах [75], тромбоцитах [94], эритроцитах [95] и лимфоцитах [90] видно, что гранулоциты обладают наименьшей активностью СОД, экзогенно генерируют супер-оксидный радикал и живут только 12—14 часов. А лимфоциты при высокой активности СОД экзогенно не генерируют супер-оксидные радикалы и живут 400 и более дней. Т.е. продолжительности жизни клеток крови во многом определяется степенью окислительного «стресса».

Влияние антиоксидантов-геропротекторов на репликативное старение диплоидных клеток человека [56].

Монослойное культивирование сопровождается закономерным изменением числа делящихся клеток в течение каждого пересева: в логарифмической фазе роста культуры, с 1-го по 3-ий день роста, – максимальное число делящихся клеток.

Монослой клеток образуется к 3-4-му дню культивирования. К 9-му дню культуры переходят в стационарную фазу, когда число делящихся клеток незначительно и плотный пласт фибробласто-подобных параллельно-ориентированных клеток.

В некоторых культурах в эти сроки клетки располагаются в несколько слоев – один слой перпендикулярно к другому. Вероятно, различные фазы роста после пересева моделируют состояние клеток в различных популяциях организма: возобновляющихся, растущих или стабильных популяциях.

Добавляя антиоксиданты на различных фазах роста культуры, мы воздействовали на клетки в состоянии деления и покоя. Культура в логарифмической фазе роста подобна быстро обновляющимся клеточным популяциям, а культура в стационарной фазе – медленно обновляющимся популяциям клеток взрослого организма.

При воздействии антиоксидантов на культуры лаг-фазы и фазы логарифмического роста, т.е. при добавлении эмоксипина в момент пересева число меченых

Н-тимидином клеток достоверно увеличивается. Для изучения влияния эмоксипина на пролиферацию клеток только в экспоненциальной фазе роста культуры препарат вводили в среду через 24 часа после пересева и фиксировали еще через 24 часа, т.е. через 48 часов после пересева. В этом случае препарат даже в высокой концентрации не влиял на пролиферацию. Число меченых клеток составило в контрольных культурах Si±? = 92,7±1,4% (11 пассаж).

В отличие от этого, введение эмоксипина в культуры, находящиеся в стационарной фазе, существенно стимулировало пролиферацию клеток. Культура стационарной фазы характеризовалась почти полным прекращением пролиферации клеток [77].

Добавление эмоксипина приводило к существенному увеличению числа меченых клеток (таблица 4).

Таблица 4. Изменение индекса меченых 

Н-тимидином клеток в стационарной культуре диплоидных клеток легкого эмбриона человека через 24 часа после добавления эмоксипина и 

Н-тимидина.

Относительно контрольных культур, которые характеризуются малой величиной числа меченых клеток (в соответствии с глубиной выраженности стационарной фазы – 11,4±3,4% и 1,8±1,4%), это увеличение выглядит более значительным (до 20,5±3,2 и 12,4±7,6% соответственно), чем в пролиферирующих культурах. Таким образом, относительная величина стимуляции возрастает с уменьшением числа ДНК-синтезирующих клеток в контрольной культуре. Под влиянием антиоксиданта число меченых клеток в стационарной фазе увеличивается примерно на 10%.

Известно, что в процессе пассирования культур диплоидных клеток человека происходит характерное для старения нормальных клеток снижение числа меченых

Н-тимидином клеток [82, 86]. Так, в наших исследованиях на 13-м и 45-м пассажах через 48 часов культивирования число меченых клеток было 80,8±5,5% и 29,0±2,2%.

Мы изучали также влияние эмоксипина на пролиферацию ДКЧ при постоянном присутствии препарата (10

М эмоксипина, на протяжениии 25 суток)

на протяжении семи пассажей (с 36-го до 42-й пассаж). В этих условиях эмоксипин замедлял снижение числа клеток, синтезирующих ДНК, по мере культивирования, то есть тормозил характерное для пролиферативного старения диплоидных клеток человека снижение пролиферации. Так, в контрольных культурах с 36-го по 42-ой пассаж доля клеток, синтезирующих ДНК, снизилась с 88,7±3,7% до 66,0±8,0%. Тогда как в присутствии 10

 М эмоксипина доля клеток, синтезирующих ДНК, на 42-ом пассаже составила только 83,6±1,7%.

Следует подчеркнуть, что в данном эксперименте при постоянном присутствии антиоксиданта в течение 7 пассажей не наблюдали изменений кариотипа и морфологии клеток. Что позволило сделать важный вывод об отсутствии токсического действия эмоксипина в дозах 10

М на нормальные клетки человека.

Эти данные хорошо согласуются с фактами стимуляции антиоксидантами митотической активности клеток паренхимы печени и клеток эпителия тонкой кишки мышей in vivo [37, 59, 60]. Добавление в пищу мышам эмоксипина стимулировало кроветворение после кровопотери у мышей старших возрастных групп [69, 70]. Показано, что при введении антиоксидантов в дозах, увеличивающих антиокислительную активность (АОА), происходит ускорение деления клеток и уменьшения среднего времени генерации.

Напротив, антиоксиданты в дозах, уменьшающих антиокислительную активность, тормозят размножение клеток, тормозя их вступление в митоз [3, 4]

Для объяснения этих экспериментальных данных было выдвинуто несколько гипотез [5, 83, 97, 98]. Гипотезу Е. Б. Бурлаковой [5, 6, 79] можно проиллюстрировать схемой, составленной по её работам и представленной на рисунке 5.

Рис. 5. Схема влияния экзогенных, эндогенных антиоксидантов и антиокислительной активности липидов на фазы клеточного цикла

(G