Гнойно-септическая инфекция в акушерстве и гинекологии

– перед взятием материала из уретры рекомендуется задержка мочеиспускания в течение полутора – двух часов;

– гнойные выделения следует удалить ватным тампоном, после чего взять соскоб эпителия;

– соскоб рекомендуется брать специальным разовым зондом, в исключительных случаях ложкой Фолькмана;

– в уретру мужчин зонд вводят на глубину 3 – 4 см, в уретру женщин – на 1 – 1,5 см, у детей материал берут с наружного отверстия уретры;

– из цервикального канала удаляют слизистую пробку, зонд вводят в канал шейки матки на глубину 0,5 – 1,5 см, при извлечении зонда исключить касание стенок влагалища;

– у новорожденных детей берут пробы с конъюнктивы века, задней стенки глотки, из вульвы, у мальчиков – мочу;

– кровь на наличие антител берут при выраженных общих проявлениях инфекции (обострение сальпингита, простатита, болезни Рейтера и т. п.).

Для диагностики урогенитального хламидиоза в настоящее время используют следующие методы:

• культуральный;

• иммунофлюоресцентный;

• иммуноферментный;

• молекулярно-биологический;

• серологический.

Культуральный метод. Этот метод считают «золотым стандартом», с которым сравнивают специфичность и чувствительность других методов. Для выделения хламидий используют клеточные линии, в которых хламидии могут размножаться – m

Coy, z-929, ВНК-21, HeZa

. Клетки выращивают в среде 199 с добавлением 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота. Суспензия клеток, содержащая 210

клеток в 1 мл среды, разливается в плоскодонные пробирки, пенициллиновые флаконы или в лунки плоскодонного планшета, в которые опускаются покровные стекла размером 7 7 мм. Монослой формируют при вертикальном положении пробирок в течение 24 ч при температуре 37 C. Через сутки среда сливается, а монослой клеток обрабатывается высокомолекулярными декстранами за 30 мин до заражения или циклогексимидом в дозе 1 – 2 мкг/мл. В пробирки с обработанным монослоем клеток вносят исследуемый материал и проводят центрифугирование для осаждения инокулята на монослой. Центрифугируют в центрифуге с горизонтальным ротором при 2500 – 3000 об./мин в течение 1 ч. После центрифугирования пробирки инкубируют 2 ч при температуре 37 C, затем инокулят удаляют, в пробирки вносят поддерживающую среду с антибиотиками и сниженным количеством сыворотки (5 %). Зараженные культуры помещаются в термостат на 48 – 72 ч, далее среда отсасывается, монослой промывается буфером, стекла вынимаются, подсушиваются и окрашиваются, одно по Маю – Грюнвальду – Гимзе, второе – моноклональными антителами. Положительный результат регистрируют по обнаружению в клетках ярко светящихся микроколоний хламидий на красно-коричневом фоне цитоплазмы. Контрастный яркозеленый свет включений хорошо различим при люминесцентном микроскопировании.

Иммунофлюоресцентный метод.Метод высокочувствителен и специфичен (85 – 90 % и 97 – 99 % соответственно). Основан на взаимодействии антигенов хламидий (ЛПС, МОМР, ОМР-2, ОМР-3, HSP, CRP и др.) со специфическими антителами. Широкий выпуск моноклональных антител налажен в Перми («Биоград») и в Москве («НИАРМЕДИК»). Диагностические наборы зарубежных фирм «Syva», «Micro Track», «Chlamyset» «Orion diagnostic» дороже отечественных, но дают меньше неспецифической флюоресценции.

Материал от больных наносится на предметные стекла или специальные деколированные стекла в пределах ограниченной площадки диаметром 7 – 10 мм вращением тампона или щеточки по стеклу. Высушенный препарат фиксируют холодным ацетоном, абсолютным спиртом в течение 5 – 10 мин. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или хранить при комнатной температуре в течение суток, при температуре 4 C – 5 – 7 дней, при 2 °C – в течение 2 недель.

• При проведении прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) на предметное стекло наносят разведение меченых антител в количестве 25 – 30 мкл. Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 мин. Подсыхание реагента недопустимо. Затем идет отмывка дистиллированной водой или фосфатным буфером (предпочтительно) в течение 20 мин на магнитной мешалке со сменой буфера через 10 мин. На высушенные мазки наносят каплю (25 мкл) забуференного глицерина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в люминесцентном микроскопе (объектив 90, окуляры 10, собственное увеличение бинокулярной насадки 1,5). Включения хламидий определяют в цитоплазме эпителиальных клеток по специфической флюоресценции корпускулярных и растворимых антигенов хламидий в виде ярко-зеленого свечения на фоне красной цитоплазмы, так как фон контрастируется синькой Эванса.

• Непрямая иммунофлюоресценция (НИФ) проходит в два этапа. На первом этапе фиксированный мазок обрабатывают антихламидийными антителами (моноклональными гибридомными). На втором этапе используют антимышиные меченые антитела к гибридомным видовым антигенам. Все остальные действия такие же, как при ПИФ.

Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от pH монтирующей жидкости или буфера, используемого при микроскопии. Интенсивность свечения увеличивается в щелочной среде, но при этом увеличивается число объектов с неспецифическим свечением, что ведет к ложноположительным результатам. Сопутствующая микрофлора гениталий, зернистость лейкоцитов, включения гликогена в клетках эпителия, слизь могут давать аутолюминесценцию, что также ведет к ошибкам в диагностике.

Для получения достоверного результата рекомендуется просматривать многие поля зрения в препарате. Результат считается положительным в тех случаях, если препарат содержит клетки эпителия (цилиндрического), не содержит десквамированного эпителия и эритроцитов и определяется более 10 элементарных телец в поле зрения. Отрицательный результат выдается в том случае, когда в препарате отсутствуют элементарные тельца, имеется 10 – 20 интактных клеток цилиндрического эпителия в поле зрения, отсутствуют лейкоциты и эритроциты.

Иммуноферментный анализ(ИФА). Применяют варианты твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов фирм «Syva», «Daco diagn.», «Abbott». Чувствительность ИФА 70 – 90 %. Главное преимущество заключается в объективном учете реакции антиген – антитело с помощью спектрофотометра. Используются антитела к хламидийным антигенам, конъюгированные с ферментами (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и др.). При положительной реакции антиген – антитело, т. е. при наличии в биопробе хламидий, высвобождается фермент, который реагирует на субстрат, специально вводимый в реагирующую смесь, при этом образуется цветное соединение. По интенсивности цвета, регистрируемой с помощью спектрофотометра, судят о наличии и количестве хламидий в материале. Современные аппараты типа Quantum, Multiscan снабжены принтером и дают распечатку полученных результатов. Для постановки реакции требуется в среднем 5 ч. Следует учитывать, что ПИФ, НИФ и ИФА могут давать положительный результат при наличии в пробе нежизнеспособных хламидий, а также (редко) других бактерий, имеющих перекрестно реагирующие антигены.

На основе ИФА построены экспресс-методы, которые выдают ответ через 5 – 15 мин. Требуется осторожность при их использовании, так как возможны ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Молекулярно-биологические методы. Они основаны на способности ДНК к гибридизации. В эту группу входят ДНК-гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР).

Все они позволяют выявить генетический материал возбудителя (уникальные высокоспецифические участки ДНК/ РНК) в исследуемом материале. В 1983 г. была открыта ПЦР и в настоящее время успешно внедряется в разные области биологии, медицины, в частности, в лабораторную диагностику инфекций.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1. Денатурация ДНК – расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК).

3. Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание нити).

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus, оптимум работы которой находится в зоне 70 – 72 C, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизма, получать достаточное количество копий ДНК для идентификации их методом электрофореза в геле или ИФА.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить синтез новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК-цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Таким образом, метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ДНК-полимеразой.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2

, где n – число циклов амплификации. Даже если в исходном материале первоначально находилась одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30 – 40 циклов амплификации накапливается 10

молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверного визуального определения этого фрагмента методом электрофореза в геле или методом ИФА. Высокая специфичность и чувствительность метода позволяет обнаружить единичных возбудителей в исследуемом материале, но требует специального оборудования, специально подготовленного персонала, знающего особенности возбудителя и способного строго контролировать технологические особенности метода. Зарубежные фирмыпроизводители диагностических наборов для ПЦР и ЛЦР – «Roch-Diagn.», «Abbott», «Murex» и др. Отечественные фирмы – «ЛИТЕХ», «НИАРМЕДИК» и др.

Серологический метод. Основан на выявлении антител к антигенам хламидий, которые циркулируют в крови или присутствуют в отделяемом слизистых оболочек в результате иммунного ответа организма на внедрение возбудителя. Большинство инфекционных процессов, вызванных C. trachomatis, локализуется в пределах слизистых оболочек, поэтому антигенная стимуляция невелика, за исключением случаев генерализации восходящей инфекции у женщин, мужчин и новорожденных детей, инфицированных в родах. Поэтому кровь для серологического исследования целесообразно брать в период ярких клинических проявлений, преимущественно системного характера. Используют метод микроиммунофлюоресценции (МИФ) и иммуноферментный анализ. Для МИФ используют реактивы фирмы «Labsystems» (Финляндия) или отечественные наборы фирмы «НИАРМЕДИК».

В качестве антигена для МИФ используется смесь элементарных и ретикулярных частиц, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов. В этой реакции определяются IgG, IgA, IgM к антигену хламидий. Постановка реакции осуществляется микрометодом. На предметное стекло наносят антиген и фиксируют холодным ацетоном 5 – 10 мин. Затем каплями наносится исследуемая сыворотка в разведении 1/4 – 1/1024, препарат инкубируется при температуре 37 C 15 мин, тщательно отмывается на магнитной мешалке фосфатно-солевым буфером 20 мин. После этого наносится антивидовая флюоресцирующая сыворотка против глобулинов человека (анти-IgG, анти-IgA, анти-IgM), инкубируется 15 мин во влажной камере при температуре 37 C. После тщательного промывания в фосфатно-солевом буфере препарат просушивается, на него наносится капля забуференного глицерина. Препарат накрывается покровным стеклом и микроскопируется в люминесцентном микроскопе. На желто-оранжевом фоне выявляются ярко-зеленые флюоресцирующие комплексы антиген – антитело в виде «звездного неба».

Иммуноферментный анализ для определения специфических IgG, IgA, IgM антител проводится в строгом соответствии с инструкцией к каждому конкретному набору.

Серологические реакции весьма ограниченно применяют для диагностики генитальных инфекций. Диагностический титр в МИФ 1/64 (IgG). При использовании ИФА об активной генитальной инфекции говорит наличие IgA > 1/16, IgG > 1/128, а также наличие IgM. При цервиците об острой или активной инфекции говорит наличие IgM > 1/20, IgG > 1/64, при сальпингите IgG > 1/128, у мужчин с негонококковыми уретритами – IgG > 1/32, при венерической лимфогранулеме IgG > 1/256. Важно определить сероконверсию в парных сыворотках, взятых с интервалом 2 нед. Лишь четырехкратное нарастание титра антител может говорить о текущей инфекции.

Антихламидийные антитела (IgG) длительно сохраняются в крови после перенесенного заболевания (5 – 10 лет), поэтому они не могут быть использованы в качестве контроля излеченности. Контроль излеченности следует проводить не ранее чем через 2 нед., предпочтительно через 2 мес., так как возможны ложноположительные результаты за счет сохранения антигенов погибших хламидий. Контроль целесообразно проводить культуральным методом или двумя взаимно дополняющими методами.

Неправильно поставленный диагноз урогенитального хламидиоза и неадекватное лечение ведет к нарушению микробиоценоза гениталий и появлению дополнительных осложнений.

УРОГЕНИТАЛЬНЫЕ МИКОПЛАЗМОЗЫ

Микоплазмы относятся к семейству Mycoplasmataceae, входящему в порядок Mycoplasmatales класса Mollicutes. Микоплазмы широко распространены в природе, они обнаружены у млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков, насекомых, растений.

Человек является естественным хозяином по крайней мере 14 видов микоплазм. Однако их патогенность для человека доказана лишь для 4 видов: Mycoplasma pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, U. urealyticum. Последние 3 вида принято называть генитальными микоплазмами.

• M. genitalium первоначально была выделена из урогенитального тракта. Однако, подобно M. pneumoniae, обладает выраженным пневмотропным действием и весьма близка с этим видом по биологическим, генетическим и антигенным свойствам. Вопрос о патогенной роли M. genitalium в поражениях урогенитального тракта окончательно не прояснен.

• M. hominis колонизирует урогенитальный тракт взрослых, детей и даже новорожденных, которые, вероятно, инфицируются при прохождении через родовые пути. У новорожденных этот вид колонизирует чаще всего глотку и вульву. У мальчиков колонизация выявляется реже, чем у девочек. В течение первого года жизни число детей, колонизированных этим видом микоплазм, постепенно уменьшается. После достижения половой зрелости и увеличения частоты половых контактов число лиц, колонизированных микоплазмами, резко возрастает. Наибольшая обсемененность половых органов M. hominis отмечена среди лиц репродуктивного возраста и коррелирует с частотой половых контактов. У мужчин M. hominis колонизирует уретру и крайнюю плоть, у женщин – влагалище, реже шейку матки и уретру, у лиц обоего пола M. hominis нередко встречается в прямой кишке.

• Ureaplasma urealyticum обладает наибольшим патогенным потенциалом для урогенитального тракта человека по сравнению с другими видами микоплазм. Уреаплазмы чаще, чем M. hominis, персистируют на слизистой уретры и цервикального канала. Более часто уреаплазмы выявляются у лиц с повышенной сексуальной активностью, а также при воспалительных заболеваниях.

Присутствие микоплазм является широко распространенным состоянием и отнюдь не всегда свидетельствует о наличии заболевания, передаваемого половым путем. Развитие патологического процесса зависит от массивности колонизации, гормонального статуса, состояния иммунитета и физиологического состояния человека. Поэтому термины «микоплазмоз» и «уреаплазмоз», применяемые в случае обнаружения соответствующих микроорганизмов, не кажутся нам оправданными, хотя четко зарегистрированы заболевания, сопровождающиеся ответной реакцией организма в виде образования специфических антител, что свидетельствует об инфекционном процессе. Клинически выраженная инфекция в виде воспалительного заболевания может иметь следствием самопроизвольное прерывание беременности, бесплодие, внутриутробное инфицирование плода.

Биологические свойства микоплазм. Микоплазмы являются самыми мелкими свободно живущими прокариотами. Средние размеры клеток составляют 0,72 – 0,34 мкм. По форме это овальные или нитевидные клетки. Отличительными особенностями микоплазм и уреаплазм являются: