Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Бурно развивающаяся в последние годы молекулярная биология обязана своими выдающимися достижениями микробиологии, которая предоставила ей микроорганизмы в качестве экспериментальных объектов. Важность исследований в области генетики микроорганизмов заключается прежде всего в том, что благодаря им впервые созданы методы управления наследственностью.

В 1865 г. чешский ученый Грегор Мендель открыл существование генов. Однако длительное время считалось, что носителем генов является белок. Микроорганизмы игнорировались как объекты генетических исследований ввиду отсутствия у них полового размножения.

В 1928 г. английский ученый Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию невирулентных пневмококков в вирулентные (ядовитые). Он заразил белых мышей смесью бактерий, состоящей из убитых нагреванием, следовательно потерявших вирулентность, капсульных пневмококков, и живых бескапсульных невирулентных пневмококков. В контрольных опытах эти группы бактерий, введенные порознь, мышей не убивали. Однако в опытной группе мыши погибли, и из крови их были выделены живые пневмококки, приобретшие капсулу убитых пневмококков. Следовательно, убитые капсульные пневмококки содержали вещество, способное передать признак капсулообразования (вирулентности) живым пневмококкам. В то же время механизм трансформации оставался нерасшифрованным.

В 1944 г. О. Эйвери с группой ученых внесли в культуру бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные пневмококки превратились в капсульные, вирулентные для мышей. Таким образом, на микробном объекте микробиологи сделали фундаментальное открытие в генетике – впервые доказали роль ДНК как носителя генетической информации. В 1953 г. Д. Уотсон и Ф. Крик определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие показало, каким образом ген выполняет свои три важнейшие функции: 1) непрерывность наследственности – полуконсервативным механизмом репликации ДНК; 2) управление структурами и функциями организма – с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех оснований (букв) – аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц); 3) эволюция организмов благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Работами Ф. Крика, С. Бреннера, М. Ниренберга, С. Очоа, Х. Кораны с использованием микробных объектов был расшифрован генетический код, показана его триплетность, неперекрываемость и универсальность для всех живых организмов.

В 1972 г. возникла и стала бурно развиваться генная инженерия. Ключевое значение для ее возникновения и управления наследственностью имело обнаружение в 1970 г. Г. Теминым, С. Мизутани, Д. Балтимором у некоторых онкогенных вирусов фермента – обратной транскриптазы (ревертазы, РНК-зависимой ДНК-полимеразы), что позволило получить на матрице информационной РНК копийную ДНК – ген и использовать его в генной инженерии. В биотехнологии, основанной на генной инженерии, широко применяются бактериальные ферменты, плазмидные и вирусные векторы, а также бактерии как основные продуценты биологических продуктов.

5.1. Структурная организация генетической информации

Прокариоты (бактерии) имеют морфологически обособленные клеточные структуры, содержащие генетическую информацию, – нуклеоиды. Нуклеоид состоит из одной свернутой в клубок хромосомы, которая свободно располагается в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поэтому бактериальная клетка, в отличие от эукариот, гаплоидна, т. е. содержит один набор генов.

В отличие от всех других организмов бактерии обладают уникальным свойством изменять массу своей ДНК, регулируя в зависимости от условий обитания содержание копий своих генов. Это позволяет бактериям регулировать скорость собственного размножения, обеспечивает выживание в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Бактериальная хромосома представляет собой двуцепочечную молекулу ДНК (кольцевую хромосому), содержащую гены, расположенные в линейном порядке. Поскольку длина хромосомы (у E. coli около 1000 мкм) во много раз превышает длину бактерии (1,5 – 3,0 мкм в среднем), хромосома компактно упакована в суперспирализованной форме в виде 12 – 80 петель, связанных с сердцевинной структурой. Геном (совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме) и генотип (совокупность индивидуальных генов) у бактерий не однозначны, но близки, так как большинство генов содержится в хромосоме в единственном числе, в отличие от эукариот, содержащих до 30 – 50 % повторяющихся последовательностей нуклеотидов в геноме. Поэтому размеры геномов у бактерий, вирусов, плазмид выражаются либо в молекулярной массе, либо количеством нуклеотидных пар геномной нуклеиновой кислоты, либо количеством генов. Эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов, а масса одного нуклеотида ДНК – 500 дальтон. Так, хромосома E. coli имеет молекулярную массу 2,8 ? 10

дальтон, количество нуклеотидных пар равно 3,8 ? 10

и содержит 2500 – 3000 генов.

Рис. 18. Сокращенная хромосомная карта E. сoli К-12 (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998)

Хромосома бактерии состоит из двух типов генов: структурных (цистронов), кодирующих синтез определенной полипептидной цепи, и регуляторных (или акцепторных), регулирующих активность генов (регуляторы, операторы, промоторы, аттенуаторы, терминаторы и др.). Основной структурно-функциональной единицей хромосомы является оперон. Это группа структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В свою очередь, оперон или их группа находятся под управлением одного гена-регулятора и представляют более сложную структурно-функциональную единицу — регулон.

Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную (генетическую) карту. Для этого устанавливают время переноса соответствующих генов при конъюгации бактерий. Локализацию генов на хромосоме определяют по времени их переноса, в частности, у кишечной палочки оно составляет от 0 до 100 мин (рис. 18).

В настоящее время основным методом изучения организации геномов микроорганизмов является секвенирование – определение последовательности расположения нуклеотидов в составе ДНК генов. Предварительно с помощью методики клонирования получают большое количество необходимых фрагментов ДНК.

Некоторые гены и группы генов хромосомы бактерий и плазмид бактерий относятся к транспонируемым генетическим элементам, т. е. генетическим структурам, способным перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например от плазмидного к бактериальному и наоборот. Транспонируемые генетические элементы представлены IS-элементами и транспозонами. IS-элементы, или вставочные последовательности (от англ. insertion sequence), имеют обычно небольшие размеры, не превышающие двух тысяч пар оснований. Они несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают: IS1, IS2, IS3 и т. д.

Транспозоны (Тп) представляют собой более крупные сегменты ДНК. Они способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома к другому. Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены также в составе геномов бактерий, плазмид, вирусов. Им принадлежит важная роль в изменчивости и эволюции живой материи. Обозначают транспозоны порядковым номером: Тп1, Тп2, Тп3 и т. д.

У многих бактерий генетическая информация может находиться помимо хромосом в особых дополнительных генетических структурах – плазмидах. Плазмида представляет собой экстрахромосомный генетический элемент, который стабильно наследуется в экстрахромосомном состоянии. Первую плазмиду F-фактор (фактор колициногенности) обнаружил у E. coli в 1925 г. А. Грация. В 1953 г. У. Хейс открыл половую плазмиду, контролирующую конъюгацию у бактерий; в 1963 г. Т. Ватанабе описал R-фактор – плазмиду, контролирующую лекарственную резистентность бактерий. Некоторые ученые относят плазмиды к живым организмам – особому классу вирусов.

Все известные плазмиды представляют собой небольшие, ковалентно-замкнутые в кольцо суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Чем больше молекулярная масса, тем сложнее набор генов и многообразнее функции плазмид. Плазмиды содержат гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды. Например, F-плазмиды определяют донорские функции клетки и способность ее к конъюгации; Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов; биодеградативные плазмиды – разрушение различных органических и неорганических соединений.

Для плазмид характерны следующие свойства:

• саморепликация;

• поверхностное исключение (механизм, который не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой, родственной ей, плазмиде);

• несовместимость (две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается удалению);

• контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки (различают малокопийные –1 – 4 копии и многокопийные – от 12 до 38 копий плазмиды);

• контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине;

• контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки;

• способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид);

• способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид);

• способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий и плазмид в природе.

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: по вертикали – путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления бактерий и по горизонтали – путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления. Между бактериальными клетками плазмиды переносятся путем конъюгации, контролируемой tra-опероном плазмиды. В зависимости от наличия этого оперона плазмиды подразделяют на конъюгативные и неконъюгативные.

Классификация плазмид основана на их уникальном свойстве несовместимости, т. е. неспособности родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду. Плазмиды, не совместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу. Например, у энтеробактерий обнаружены 39 Inc-групп плазмид.

Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают многими общими признаками. Плазмиды имеют важное медицинское значение, так как контролируют синтез различных факторов патогенности бактерий и их лекарственной резистентности. Общебиологическое значение плазмид состоит в том, что они являются уникальным средством самозащиты бактерий и способствуют сохранению их в природе.

5.2. Передача и реализация генетической информации

Передача генетической информации потомству (вегетативная репликация ДНК) осуществляется у бактерий и плазмид по универсальному механизму – полуконсервативной репликацией ДНК. При этом дочерние клетки получают ДНК хромосомы, у которой одна нить родительская (консервативная), другая нить ДНК вновь синтезирована на ее матрице, что обеспечивает очень точную передачу генетической информации (наследственность). Вегетативная репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы (oriC), который распознается ферментами, инициирующими репликацию. Она происходит одновременно в двух направлениях и заканчивается в строго фиксированной точке — terminus.Поскольку цепи ДНК непараллельны (если одна нить начинается с 5-го конца, то другая – с 3-го конца), а ДНК-полимераза III синтезирует ДНК только в направлении 5 – 3, репликация происходит на каждой нити по-разному: на одной из расплетенных нитей («прямой», «лидерной») она идет непрерывно, а на другой («отстающей») должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5 – 3, прерывисто, через образование сегментов Оказаки длиной около 1000 нуклеотидов у бактерий (рис. 19).

Скорость репликации ДНК у E. coli при температуре 37 °C соответствует включению 2 ? 10

пар нуклеотидов в 1 с. В репликации ДНК участвует комплекс ферментов, образующих единую структуру — реплисому. Генетический контроль репликации ДНК осуществляет большая группа генов хромосомы.

Рис. 19. Схема вегетативной репликации ДНК (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998)

Помимо вегетативного у бактерий имеются конъюгативный и репаративный типы репликации ДНК. Конъюгативная репликация происходит при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами (tra-оперон). При этом осуществляется достройка второй, комплементарной нити ДНК, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация служит механизмом устранения из ДНК структурных повреждений и происходит на заключительном этапе генетической рекомбинации. Она контролируется хромосомными и плазмидными генами.

Информация, содержащаяся в геноме бактерий, расшифровывается, материализуется и реализуется путем биосинтеза белка. Универсальности генетического кода соответствует универсальность его расшифровки и реализации (экспрессии). Однако биосинтез белка у бактерий имеет некоторые особенности на этапе транскрипции. Гены бактерий, в отличие от генов эукариот и вирусов, не содержат интронов, поэтому у бактерий отсутствует сплайсинг при синтезе мРНК. Сплайсинг РНК – процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате чего образуется и затем транслируется зрелая мРНК. Отсутствие сплайсинга РНК у бактерий является естественным генетическим барьером в реализации генетической информации эукариот у бактерий (прокариот). Преодоление этого барьера привело к созданию генной инженерии на бактериальных объектах.

Генетическая информация реализуется микроорганизмами весьма «экономно», в соответствии с конкретными условиями их существования. «Работают» (экспресcируются) только гены, необходимые для обеспечения жизнеспособности клетки в данных условиях. Саморегуляция системы генетической информации обеспечивается наличием в ней помимо структурных генов, кодирующих белки и другие макромолекулы, особых последовательностей нуклеотидов (акцепторных или регуляторных генов), не имеющих кодирующих функций, но управляющих работой структурных генов. Как уже упоминалось, совокупность расположенных рядом структурных и регуляторных генов составляет оперон-единицу генетической регуляции. Классической моделью оперона является лактозный оперон. Рассмотрим на примере лактозного оперона кишечной палочки его устройство и способ регуляции активности структурных генов, кодирующих синтез ферментов, участвующих в усвоении лактозы.

Начинается оперон (рис. 20) с «участка прикрепления белка-активатора» – продукта вышестоящего регулона (Сар-белка, без которого РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию). Далее на хромосоме расположен промотор – участок распознавания РНК-полимеразой и прикрепления ее, затем следует оператор – участок, с которым связывается особый тормозящий транскрипцию белок-регулятор. После оператора расположены последовательно структурные гены z, y, a, кодирующие соответственно синтез трех ферментов, участвующих в усвоении лактозы: ?-галактозидазы, ?-галактозидпермеазы и тиогалактозидтрансацетилазы. Заканчивается lac-оперон терминатором — небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона. Вне lac-оперона, на другом месте хромосомы находится особый ген-регулятор, кодирующий непрерывный синтез белка-регулятора.

Рис. 20. Схема функционирования lac-оперона (по: Коротяев А., Бабичев С., 1998) 1 – работа оперона блокирована репрессором; 2 – оперон активно работает, молекулы репрессора инактивированы индуктором

Когда в окружающей среде нет лактозы, белок-регулятор прикрепляется к оперону и препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, подавляя транскрипцию и, в конечном итоге, синтез ферментов. Лактоза, присутствующая в питательной среде, связывается с белком-регулятором, изменяя его конфигурацию, в результате чего белок-регулятор уже не может прикрепляться к оператору. В итоге «шлагбаум» открыт и РНК-полимераза транскрибирует структурные гены в соответствующие мРНК, на матрице которых синтезируются ферменты, усваивающие лактозу.

Таким образом, лактоза индуцирует синтез ферментов, нужных для ее усвоения. Такие ферменты называются адаптивными, или индуктивными. Рассмотренный тип регуляции активности генов называется негативным, так как в его основе лежит репрессия оперона белком-регулятором. Есть два варианта этого типа регуляции: негативная индукция, которую мы рассмотрели, и негативная репрессия.

В последнем случае в исходном положении белок-регулятор не может связываться с оператором и синтез ферментов идет, а при наличии эффектора, обычно конечного продукта действия анаболических ферментов, белок-регулятор под его воздействием связывается с оператором и синтез ферментов подавляется. Кроме негативного известен также позитивный тип генетической регуляции синтеза белка. Отличие его от негативного типа заключается в том, что белковый продукт гена-регулятора не исключает транскрипции оперона, а, наоборот, активирует ее.

5.3. Изменчивость, ее формы и механизмы

Ненаследственная (модификационная) изменчивость

Проявление признаков живых организмов, контролируемых генотипом, зависит от условий существования организма. Совокупность признаков организма в конкретных условиях его существования называется фенотипом. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут иметь различные фенотипы, так как реализуется различная часть генетической информации генотипа или реализация происходит в различном диапазоне нормы реакции генотипа. Смена фенотипов при смене условий существования организма называется модификацией. Иными словами, модификации – это фенотипические различия, вызываемые внешними факторами у микроорганизмов с одинаковой наследственностью.

Отличительными признаками модификации у бактерий являются: