Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги

-5,90 %, P

O

-8,89 %, CO

-40,90 %. Следует отметить высокое содержание калия и натрия в золе чаги – около 52 % всей золы. При этом содержание калия почти в 5-6 раз больше, чем натрия. Преобладание в золе калия, особенно активно участвующего в метаболизме растительных клеток и тканей, указывает на интенсивный приток продуктов ассимиляции внутрь наростов чаги [55].

Анализ золы каждого из слоев чаги позволил обнаружить следующие элементы: в верхнем слое – Si, P (следы), Na, K, Cu, Mg, Ca, Zn, Al, Mn, Fe; в срединном плотном слое – Si, P (следы), Na, K (много), Ag (следы), Cu, Mg, Al, Mn, Fe; во внутреннем рыхлом слое – Si, P, Na, K, Ag (следы), Cu, Mg, Al, Mn, Fe. При этом наибольшее количество золы дает верхний и средний плотный слой наростов чаги. В более поздних исследованиях [81,52] с использованием рентгено-флюоресцентной адсорбции и атомно-адсорбционной спектроскопии в чаге были определены следующие элементы: С – 39 %, Н – 3,6 %, O – 40-45 %, N – 0,4 %, K – 9–10 %, Mg – 0,64 %, Ca – 0,37 %, Cl – 0,33 %, P – 0,23 %, Na – 0,05 %, Rb – 0,04 %, S – 0,02 %, Mn – 0,02 %, Fe, Cu, Zn, V, Cr, следы Ni, Se, J, Ba, Br и Sr. Сравнение приведенных результатов с данными, полученными в работе [55], показывает, что состав зольных элементов чаги отличается, но сохраняется закономерность преобладания в золе калия над натрием. Распределение веществ по фракциям, экстрагируемым из гриба различными растворителями. Анализ эфирных и ацетоновых вытяжек из чаги [56] показал, что содержание ацетонорастворимых веществ (2,26 – 2,92 %, – здесь и далее приведены значения в двух слоях) во всех слоях чаги выше, чем веществ извлекаемых эфиром (1,10 – 1,39 %). После обезжиривания сырья была проведена водная экстракция чаги (содержание сухих веществ составило 36 – 40 и 30 – 32 % соответственно), а также её экстракция 2 % раствором НСl (17,60 – 17,90 %). Самое высокое содержание в водных экстрактах чаги составляют вещества, осаждаемые из них НСl, то есть полифенолоксикарбоновый или хромогенный комплекс или меланин (16,04 – 15,08 %). Содержание клетчатки в чаге составило 1,79 и 5,50 %, гемицеллюлоз 8,30 – 10,40 %, а лигнина 29,10 и 28,02 %. Это свидетельствует о том, что чага ассимилирует больше лигнина для включения в свой метаболизм по сравнению с клетчаткой и сопутствующие им полисахариды. Показано, что лигнин чаги представляет собой темно-коричневую комковатую массу, легко растворяющуюся в щелочах, дающий при щелочно-нитробензольном окислении вещества с запахом ванилина. Характерным для данного лигнина является также отсутствие реакции с фенолом [56]. Установлено [138], что водорастворимый лигнин, выделенный из гриба чаги, подавляет действие протеазы вируса иммунодефицита человека в количестве 2,5 мкг/мл.

Интересно отметить, что в чаге практически не содержатся редуцирующие сахара, зато присутствует большое количество полисахаридов (4,80 %) синтезируемых грибом. Особый интерес вызывает то, что при экстракции чаги эфиром и ацетоном в экстракты переходит достаточно большое количество общего азота (5,10 – 6,50 и 5,80 – 6,00 мг/100 г чаги соответственно). То есть можно предположить, что белок чаги имеет достаточно много липофильных участков либо связан с липофильными веществами, если при экстракции чаги ацетоном или эфиром переходит в извлечение. В водное и кислое извлечение переходит очень мало азотсодержащих веществ менее 0,18 мг/100 г чаги. Малое количество водорастворимого азота, по мнению авторов, объясняется тем, что и в самой чаге содержание азота очень незначительно.

В более ранней работе Драгендорфа Г. [139] также показано низкое содержание азота в чаге. В другой работе [140] проводилось определение содержания в чаге общего азота по полумикрометоду Къельдаля, белкового азота по методу Барнштейна и сырого белка путем умножения количества белкового азота на коэффициент 6,25. Было показано, что чага содержит: азот общий – 0,45 % от абсолютно сухого веса гриба; азот белковый – 0,41 %; сырой белок – 2,56 %. Таким образом, авторами было установлено, что практически весь азот чаги представлен белковым азотом. В более поздних исследованиях [95,141] определено наличие в чаге лектинов – веществ, относящихся к классу сложных гликопротеинов. Cогласно литературным данным [142,143], лектины могут стимулировать рост и деление лимфоцитов, участвовать в регуляции иммунологических реакций, блокировать рецепторы опухолевых клеток, подавляя их миграцию.

Изучение кислотного состава чаги показало наличие в грибе летучих органических кислот: муравьиной – 0,078 %; уксусной – 0,108 %; масляной – 0,076 % на сухой вес гриба[144]. Содержание щавелевой кислоты составляет 0,88 – 1,21 %, а ароматических кислот, представленных сиреневой, ванилиновой, п-оксибензойной и протокатеховой кислотами, – 0,28 – 0,31 % [56]. Кроме этого, выделены и идентифицированы кофейная и 2,5-дигидрокситерефталевая кислота, а также 3,4-дигидроксибензальдегид, 3,4дигидроксибензилацетон и 2-гидрокси-1-гидроксиметилэтиловый эфир 4-гидрокси-3,5-диметоксибензойной кислоты [20].

Флуориметрическим методом в работе [145] показано наличие в чаге птериновых соединений типа фолиевой кислоты в количестве 6 – 10 мг/г, которые, по мнению авторов, могут обусловливать лечебное действие чаги.

Стерины и тритерпены, извлекаемые из гриба чаги. В исследованиях Ловягиной и Шивриной [146,147] проведено определение суммы стеринов и тритерпеновых кислот в чаге. Показано, что содержание стероидных веществ, извлекаемых спиртом, составляет 2,70 % от сухого веса гриба, неомыляемых веществ – 0,85 %, тритерпеновых кислот – 0,04 %. Из неомыляемой фракции спиртовой вытяжки чаги авторами было выделено в кристаллическом состоянии пять соединений [148-150,2-3]. Они были идентифицированы как ланостерол, производное ланостерола, инотодиол и эргостерол, а также обликвиновая и инонотовая кислоты. Все выделенные соединения были проверены на антибластомную активность in vitro против асцитного рака Эрлиха. Показано, что заметным действием на раковые клетки обладал инотодиол [146], кроме того, он ингибировал устойчивость колоний раковых клеток к лекарственным препаратам [19].

Рисунок 2 Структурные формулы идентифицированных ве ществ, выделенных из природной и культивируемой чаги (Вещества, отмеченные *, выделены из мицелия культивируемой чаги) [22]

Исследования, проведенные финляндским ученым Каhlos K., позволили подробно и глубоко изучить состав тритерпенов чаги и их биологическую активность, в частности, противоопухолевое действие [12-14]. В экстрактах, полученных путем обработки чаги 95 % этанолом, идентифицированы терпены, представленные на рисунке 2 [22].

Фенольные соединения, извлекаемые из гриба чаги. Исследуя 50 % этанольные экстракты природной чаги (ПЧ) и фильтрат культивируемой чаги (КЧ), Зхенг с соавторами [151] пришёл к выводу о различии биосинтеза фенольных соединений указанными объектами исследования. С помощью ВЭЖХ авторами идентифицированы 15 соединений фенольной природы, содержащихся в ПЧ (82,99 %), и 12 соединений этого класса – в КЧ (79,73 %).Показано, что в КЧ преобладают флавоноиды: кемпферол, нарингин, нарингенин, нарирутин, EGC (эпигаллокатехин), ECG (эпикатехингаллат), фортунелетин; присутствует незначительное количество меланина и в следовом количестве наблюдаются аналоги гиспидина (6-(3,4дигидроксистирил) -4-гидрокси-2-пирон); галловую и ферулловую кислоты было трудно определить.

Из фенольных соединений в ПЧ преобладают аналоги гиспидина, включая феллигридины (phelligridins) А и D, иноскавины (inoscavins) А и В, а также меланин. В небольших количествах в ней обнаружены галловая, ферулловая кислоты и флавоноиды (фортунелетин, нарингенин, кемпферол, EGC (эпигаллокатехин), нарирутин). Как в ПЧ, так и в КЧ были обнаружены фенилаланин и тирозин. В более ранних исследованиях [152,153] в ПЧ также были обнаружены аналоги гиспидина, включая иноскавины А, В и С, инобилины (inobilins) А, В и С , феллигридины D , E и G (рисунок 3).

Рисунок 3 Структурные формулы инобилинов А (1 ), В(2), С (3), феллигридинов D (4), E (5), G (6) и иноскавина А (7)

Эти соединения показали высокую активность по отношению к ABTS (2,2’-азинобис-3-этилбензотазолин-6-сульфоновая кислота) радикалам и DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгдразил) радикалам и умеренную активность по отношению к супероксид анион радикалу. Электронный потенциал (E°') рассматривают как меру реакционной способности антиоксиданта, как донора водорода или электрона в стандартных условиях. Более низкие значения E°' указывают на то, что требуется меньше энергии для отдачи молекулой водорода или электрона. Катехины имеют значения E°' (EGC = 430мВ, ECG = 550мВ) на уровне со значением E°' для витамина Е (480мВ), но выше, чем у витамина С(280мВ) [154].

Предполагают, что эти соединения образуются из гиспидина, синтезируемого на основе фенилаланина по поликетидному пути [153]. Гиспидин растворим в ДМСО и нерастворим в воде. Необходимо отметить, что гиспидин является ингибитором протеинкиназы С (РКС) ?I и ?II изоформ [155]. Установлено [156], что высокоочищенный гиспидин в концентрации от 10

до 10

М/л обладает цитотоксичностью в отношении фибробластов MRC-5 человека и клеток рака человека – кератиноцитов (SCL-1), а также клеток рака поджелудочной железы (Capan-1). В тоже время он не проявляет цитотоксичность к здоровым клеткам организма человека. В работе Зхенга с соавторами [151] показано, что при использовании в качестве иммунодепрессанта циклофосфамида восстановление иммунной системы мышей и их жизненного статуса при применении ПЧ оказалось в два раза более эффективным, чем применение КЧ. Ранее было установлено, что длительное применение циклофосфамида разрушает ДНК лимфоцитов и таким образом приводит к их апоптозу. Соответственно, циклофосфамид приводит к угнетению как клеточного, так и гуморального иммунитета. Это означает, что аналоги гиспидина и меланин более эффективно защищают ДНК лимфоцитов от окислительного повреждения у мышей с подавленной иммунной системой, чем флаваноиды, а также повышают потенциал пролиферации лимфоцитов HIV [157] и эффективны в отношении вирусов гриппа HINI и H3N2 [158].

Водные извлечения чаги

Основным отличительным свойством чаги от других трутовиков является большое количество в ней водорастворимых веществ [56]. Основным компонентом водных извлечений из чаги являлся меланин, количество которого составляет 50-60 % от их сухого остатка [56-57,147, 159].

Зольные элементы в препаратах чаги составляют почти 28-30 % от сухого остатка препаратов чаги. Они представлены: SiO

– 1,64 %; R

O

– 0,38 %; MgO – 1,86 %; CaO – следы; Mn

O

– 1,04 %; Na

O – 13,32 %; K

O – 62,70 % от всей золы[55]. В другом исследовании показано наличие в водных извлечениях чаги K 55,0 мг/г, Mg 2,1 мг/г, Na 0,18 мг/г, Ca 0,39 мг/г, Mg 0,15 мг/г, Zn 0,1 мг/г, Al 0,052 мг/г, Fe 0,035 мг/г, B 0,033 мг/г, Ba 0,011 мг/г, Сu 0,0079 мг/г и Cd, Cr, Ni, Pb в следовых количествах [15]. При этом показано, что практически все соли калия, натрия и большая часть катионов магния, марганца переходят из сырья в водный экстракт чаги.

При проведении водной экстракции чаги без предварительного обезжиривания сырья, в целом, количество извлекаемых веществ и их качественный состав существенно не изменяется. Снижается количество птериновых соединений, а также стеринов и тритерпенов [146]. Алкалоидов в водном извлечении чаги не обнаружено [139, 159].

П.А. Якимов [160] охарактеризовал водные извлечения чаги как коллоидные полидисперсные гидрофильные системы, дисперсная фаза которых представлена полифенолоксикарбоновым комплексом – меланином. Агрегативная устойчивость лиофильных коллоидных систем не остается постоянной. Уже при не длительном хранении водных коллоидных систем самопроизвольно возникают явления агрегации, которые ведут к последовательной седиментации потерявших кинетическую устойчивость укрупненных коллоидных частиц.

Для оценки содержания меланина в получаемых водных извлечениях практическое применение имеет его осаждение соляной кислотой. Именно с количественным содержанием меланина в водном извлечении чаги связывают терапевтическую эффективность фармакологических препаратов, получаемых на его основе [53,161]. Агрегативная устойчивость меланина резко снижается при изменении значения рН водного извлечения добавлением других минеральных и некоторых органических кислот [64]. Показано, что с помощью добавления различного количества кислоты можно получить различные фракции дисперсной фазы. При изменении исходного значения рН с 5,9 до 4,7 наблюдается выпадение темноокрашенной части осадка. Повторное подкисление фильтрата позволяет получить из него менее окрашенные фракции. Каждая из примененных минеральных кислот полностью осаждала меланин при значении рН среды, равной 2,2 и ниже. Щавелевая кислота даже при рН среды 1,9 осаждала две трети меланина, уксусная кислота не осаждала его совсем.

Процесс седиментации дисперсной фазы может быть проведён добавлением к водному извлечению чаги специально подобранных электролитов из числа нейтральных солей [64]. Авторами проведено исследование агрегативной устойчивости коллоидной системы водного извлечения чаги с содержанием сухих веществ 1,2 % растворами солевых электролитов различной концентрации. При применении максимальной концентрации раствора хлористого натрия (32 %) в осадок выпадало только 44,1 % меланина, что может свидетельствовать об относительно высокой устойчивости дисперсной фазы водного извлечения чаги к нейтральным солям одновалентных катионов. При добавлении 8 % раствора хлористого кальция из водной вытяжки чаги осаждалось почти в 2 раза больше меланина, чем при добавлении насыщенного раствора хлорида натрия. Применение в качестве осаждающего агента раствора алюмокалиевых квасцов в той же концентрации (8 %) вызывало почти полное осаждении меланина (98,72 %). Растворы уксуснокислого свинца даже в незначительной концентрации (2 %) осаждали меланин полностью (98,90 %).

Для определения отличий в структурной организации коллоидных систем водных извлечений, полученных различными способами экстракции, они были исследованы с помощью ЯМР-релаксации. [162] Данный метод позволяет определить относительные изменения в строении и молекулярной подвижности компонентов меланина в зависимости от его состояния (в сырье, в водном извлечении, в твердом состоянии). На рисунке 4 представлены температурные зависимости спин-решеточной релаксации (Т

) водных извлечений чаги, полученных различными методами экстракции: реперколяцией, ремацерацией и с механическим перемешиванием среды [162, 243-248]. Времена спин-спиновой релаксации (Т

) исследуемых образцов меняются аналогично (Т

), и поэтому не приводятся. Как видно на рисунке 5, условная ширина спектров времен корреляции ? (?~Т

/Т

) меняется с температурой по экстремальному закону с общим максимумом для образцов, получаемых методами ремацерации (система 1) и реперколяции (система 2) в области 50 ?С, а при использовании механического перемешивания (система 3) в области 60?70 ?С. Согласно полученным результатам, каждый из применённых способов экстракции приводит к формированию индивидуальной коллоидной системы с соответствующими значениями параметров релаксации.

Анализ данных в области 70 ?С (температуры проведения экстракции) показывает, что релаксационные характеристики коллоидной системы 2 могут быть представлены как среднее значение соответствующих параметров для систем 1 и 3 (рисунки 4 и 5) [192].

Рисунок 4 Температурная зависимость времен спин-решеточной релаксации водных извлечений чаги.

1 – механическое перемешивание;

2 – ремацерация;

3 – реперколяция.

Рисунок 5 Температурная зависимость условной ширины спектра времен корреляции водных извлечений чаги (?=Т

/Т

).

1 – механическое перемешивание;

2 – ремацерация;

3 – реперколяция.