Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Особенности регуляции выражения генетической информации у бактерий

В отличие от вегетативной репликации, цель которой – обеспечить передачу по наследству всех генов и которая происходит последовательно от начала до конца хромосомы, выражение генетической информации, т. е. работа генов, подчиняется другой цели, а именно – осуществлению за короткий срок жизненного цикла клетки. Поскольку он включает в себя множество биохимических реакций, сопряженных между собой, это предполагает хорошо согласованную во времени работу генов. Такая их согласованность возможна лишь при определенном жестком и четком управлении ими. Действительно, как было давно установлено, основной структурнофункциональной единицей хромосомы является оперон. Он представляет собой группу структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В состав оперона, как правило, входят структурные цистроны, определяющие синтез ферментов, которые участвуют в цикле связанных между собой биохимических реакций. Ген-оператор управляет одновременно всей группой структурных генов, которые образуют оперон, иначе говоря, оперон функционирует как самостоятельная единица. В свою очередь, оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора. Так возникает более сложная структурно-функциональная единица – регулон. Регулон представляет собой систему, состоящую из гена-регулятора и одного или нескольких оперонов, находящихся под контролем одного гена-регулятора.

Важным структурным элементом оперона является промQотор – область, с которой взаимодействует РНК-полимераза. В составе оперонов могут быть и различные другие регуляторные элементы – энхансеры, аттенуаторы, терминаторы и т. п.

Энхансер (англ. enhance – усиливать) – генетический элемент, усиливающий транскрипцию оперона.

Аттенуатор (англ. attenuate – разрежать, разбавлять) – генетический элемент, ослабляющий работу оперона. Аттенуатор – последовательность нуклеотидов, расположенная между промоторным операторным участком оперона и его первым структурным опероном; она кодирует лидерную РНК, ее длина около 150 пар нуклеотидов.

Терминатор (англ. terminate – заканчивать) – особый участок в структуре аттенуатора (лидерной последовательности), от которого зависит образование участка мРНК, блокирующего синтез лидерной РНК перед началом первого структурного гена соответствующего оперона.

Очень важным для понимания того, как регулируется выражение генетической информации, содержащейся в хромосоме, является вопрос о том, в какой последовательности работает оперон. До 1960-х гг. предполагали, что транскрипция сопряжена с репликацией, поскольку для той и другой необходимо разделение нитей. В соответствии с этой моделью транскрипция начиналась из той же точки, что и репликация, и осуществлялась последовательно вдоль всей ДНК. В 1969 г. А. И. Коротяевым было постулировано и обосновано положение о том, что репликация и транскрипция идут независимо друг от друга, поскольку скорости их не сопоставимы, и поэтому каждый оперон имеет равную возможность для своего выражения в ходе жизненного цикла клетки – гипотеза равновероятностного выражения оперонов. Образно говоря, хромосому клетки можно сравнить с пианино. В хромосоме гены располагаются последовательно один за другим, контролируя разные реакции. У пианино клавиши располагаются также последовательно – в соответствии с нотами и октавами. Законченное музыкальное произведение создается не путем последовательного извлечения звуков вдоль клавиатуры, а путем их избирательной композиции. Выбор композиции – это и есть произведение. Точно так же для того, чтобы в клетке осуществлялось такое сочетание биохимических процессов, которое бы приводило к образованию законченных продуктов-белков, необходим правильный выбор соответствующих генов, ибо совокупность биохимических реакций, ведущих к синтезу необходимого продукта (продуктов), – это и есть законченное произведение «генетического пианино». Партитура этих произведений написана эволюцией живой материи.

Классическим примером организации и работы оперона служит модель лактозного оперона. Лактоза – дисахарид, она состоит из галактозы и глюкозы, соединенных ?-галактозидной связью. Поэтому фермент, разрушающий эти связи, получил название ?-галактозидазы. Лактозный оперон (рис. 44) содержит гены, которые контролируют синтез ферментов, участвующих в превращении лактозы: ?-галактозидазу (z), галактозидпермеазу (y) и тиогалактозидтрансацетилазу (a). Ген-оператор (о) управляет одновременно выражением всей группы этих генов. В его составе содержится промотор (р), с которым взаимодействует РНК-полимераза. Лактозный оперон содержит 5500 нуклеотидных пар, в том числе: область о + р – 50 нуклеотидных пар; цистрон z – 3700 нуклеотидных пар; цистрон y – 900 нуклеотидных пар; цистрон a – 900 нуклеотидных пар.

Рис. 44. Схема функционирования lac-оперона:

1 – работа оперона блокирована репрессором; 2 – оперон активно работает, молекулы репрессора инактивированы индуктором

Работа оперона находится под негативным контролем гена-регулятора (i), который контролирует синтез белка-репрессора. Белок-репрессор имеет м. м. около 150 – 200 кД. Он состоит из четырех субъединиц, имеющих м. м. 38 кД. Репрессор имеет два активных участка: с одним из них взаимодействует индуктор (лактоза или ее структурный аналог), а с помощью другого он прикрепляется к оператору. В отсутствие лактозы белок-репрессор связывается с оператором и блокирует выражение этого оперона. Когда в среде появляется лактоза, она связывается со вторым активным участком репрессора, это приводит к изменению его конформации по типу аллостерического эффекта, и он становится неактивным, репрессия оперона снимается, происходит активный синтез ферментов.

Негативный контроль работы лактозного оперона хорошо объясняет сущность феномена индукции: нет индуктора – оперон молчит, его работа заблокирована. Появился индуктор – оперон разблокирован и активно работает.

В основе другого феномена – феномена репрессии – лежит тот же принцип регуляции. Однако в репрессируемой системе ген-регулятор контролирует синтез апорепрессора, т. е. неактивного репрессора. Апорепрессор также имеет два активных центра: один – для взаимодействия с метаболитом (корепрессором), а другой – для специфического связывания с геном-оператором. Апорепрессор становится активным и подавляет работу оперона лишь после взаимодействия с соответствующим корепрессором (метаболитом).

Типичным примером репрессируемой системы является система синтеза ферментов пути образования триптофана у E. coli (рис. 45). В отсутствие триптофана апорепрессор неактивен и не блокирует работы триптофанового оперона. При избыточном содержании триптофана в среде, в которой размножается E. coli, он, выполняя роль корепрессора, связывается с апорепрессором и вызывает его аллостерическое превращение в активный репрессор. Последний связывается с геном-оператором, что и приводит к прекращению дальнейшей транскрипции структурных цистронов этого оперона и подавлению синтеза ферментов. Особенностью триптофанового оперона является наличие в нем между промоторно-операторным участком и его первым структурным цистроном особой последовательности приблизительно из 150 пар нуклеотидов, получившей название лидерной последовательности, или аттенуатора. Роль аттенуатора состоит в регуляции активности РНК-полимеразы. Суть феномена аттенуации заключается в том, что даже при незначительном избытке триптофана в клетке транскрипция оперона большинством молекул РНК-полимераз преждевременно обрывается в области аттенуатора (его терминатора). По мере же снижения концентрации триптофана все больше и больше молекул РНК-полимераз «проскакивают» этот участок и становятся способными транскрибировать весь оперон. Наоборот, при большом избытке триптофана его молекулы переводят апорепрессор в корепрессор, и транскрипция оперона подавляется. Следовательно, при наличии аттенуатора синтез ферментов может происходить как по правилу «все или ничего», так и по типу «больше – меньше». Аттенуаторы обнаружены и в других оперонах, осуществляя более экономичную их регуляцию.

Рис. 45. Функционирование триптофанового оперона:

а – аттенуатор; о – оператор; р – промотор

Помимо негативных, существуют и позитивные механизмы контроля выражения генетической информации. Они были обнаружены при изучении арабинозного оперона у E. coli (рис. 46). Этот оперон включает три гена – araA, araB, araD (1 мин), кодирующих синтез ферментов, и три гена – araE (61 мин), araF, araG (45 мин), кодирующих транспортные белки. Они расположены в разных участках хромосомы и образуют три самостоятельных оперона, один из которых состоит из трех сцепленных структурных генов (araBAD).

Выражение всех оперонов контролируется геном araC, расположенным рядом с проксимальным концом araBAD-оперона и отделенным от него общей регуляторной областью. Продукт гена araC – аллостерический белок, который может существовать в двух альтернативных конформациях: Р1 – сам белок; Р2 – белок в комплексе с арабинозой. Белок Р1 является репрессором для всех оперонов (araBAD, araE и araG). Белок Р2 в результате взаимодействия с арабинозой изменяет свою конформацию (аллостерический эффект) и выступает в качестве активатора araBAD-оперона. Следовательно, продукт гена araC осуществляет как негативную, так и позитивную регуляцию транскрипции.

В регуляторной области имеются следующие участки: промотор; инициатор (с ним связывается Р2); участок, с которым связывается белок-активатор катаболизма (БАК) в комплексе с цАМФ и оператор (место связывания Р1). При наличии в среде арабинозы Р1 связывается с ней и превращается в активатор Р2. Поэтому комплекс БАК – цАМФ присоединяется к соответствующему участку ДНК. В результате этого Р2 стабильно связывается с инициатором и стимулирует присоединение к промотору все новых молекул РНК-полимеразы, а последние осуществляют многократную транскрипцию araBAD-оперона и соответственно происходит многократная трансляция. При отсутствии арабинозы или при ее полном потреблении Р2 возвращается в репрессорную форму Р1 и блокирует оператор.

Рис. 46. Модель негативно-позитивного контроля выражения L-арабинозной системы.

Цифры обозначают число пар нуклеотидов в генах

Система позитивного контроля является необходимым атрибутом координированного управления различными оперонами. Так, например, в арабинозной системе пермеазный ген (araE) пространственно разобщен со всеми остальными генами. Если он является частью какого-то другого оперона (оперона Х), он требует позитивного контроля в форме активатора (Р2), чтобы вывести его из-под контроля, осуществляемого опероном Х.

Таким образом, благодаря сочетанию механизмов индукции и репрессии, негативного и позитивного контроля выражения генетической информации, обеспечивается определенная координация между различными функциональными группами оперонов.

В конце XX в. был обнаружен еще один механизм регуляции передачи генетической информации. Он получил название РНК-интерференция (RNA-interference), или РНК-и, а проще назвать этот процесс контролем, или цензурой потока генетической информации с помощью двухцепочечной РНК, поскольку именно такую, «цензорную» функцию выполняет двухцепочечная РНК.

Еще в начале 80-х гг. XX в. в опытах с E. coli было установлено, что введение в клетку синтетических фрагментов одноцепочечной РНК может приводить к блокированию некоторых генов. В 1997 г. американские ученые Эндрю Файер (Andrew Z. Fire) и Крэйг Мелло (Craig C. Mello) с группой соавторов в опытах с червем Caenorhabditis elegans установили, что такое блокирование генов происходит значительно эффективнее, если вводить короткие фрагменты не одно-, а двухцепочечной РНК. (Статья об этом открытии была опубликована в журнале «Nature», Vol. 391, 19 February 1998, pp. 806 – 811). К. Мелло дал этому феномену название «РНК-интерференция». Механизм РНК-интерференции пока полностью не изучен и заключается, по-видимому, в следующем. При попадании в клетку молекулы двухцепочечной РНК индуцируют работу группы ферментов, которые разрезают РНК на очень короткие фрагменты, затем расплетают их на отдельные нити и с помощью этих нитей удаляют из мРНК соответствующие участки. В результате этого содержащаяся в них информация утрачивается и не доходит до рибосом. Этот механизм оказался универсальным. Им владеют все живые существа от бактерий до млекопитающих. С помощью этого механизма прицельного блокирования (генной цензуры), осуществляемого РНК-и, разрушается попавшая в организм чужеродная генетическая информация (например, различных вирусов) и контролируется работа собственных генов, т. е. подавляется работа тех из них, в которых возникли опасные мутации, или вырезаются и уничтожаются транспозоны, которые могут вызвать опасные мутации. За открытие этого фундаментального механизма регуляции переноса генетической информации Э. Файер и К. Мелло в 2006 г. были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Эти исследования помогут разработке более эффективных способов профилактики и лечения тех заболеваний, от которых в настоящее время умирает больше всего людей, а именно: сердечно-сосудистых, онкологических и вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции и гепатитов).

Глава 11

Формы обмена генетическим материалом у бактерий

Помимо основного механизма передачи генов – по наследству (по вертикали), у бактерий существуют следующие формы обмена генетическим материалом по горизонтали, т. е. между отдельными особями в популяции клеток: трансформация, трансфекция, трансдукция, конъюгация и сексдукция.

Трансформация – перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная (искусственно получаемая) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду вследствие их лизиса или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Как спонтанная, так и индуцированная трансформация сводится, по сути, к поглощению трансформирующей ДНК и образованию рекомбинантов, причем спонтанная трансформация может происходить в результате взаимного обмена ДНК. Эффективность индуцируемой трансформации во многом зависит от физиологического состояния клеток-реципиентов. Они должны находиться в состоянии своеобразной компетентности для этого процесса. Предполагается, что в фазе компетентности происходят значительные изменения поверхностных слоев клетки, которые способствуют поглощению ДНК. В частности, аутолитические ферменты клетки растворяют клеточную стенку в тех участках, где происходит ее синтез. При этом мезосомы через образовавшиеся отверстия соприкасаются с внешней средой, адсорбируют и втягивают внутрь клетки трансформирующую ДНК, где она и вступает в рекомбинацию с ДНК реципиента. В результате этого образуется мерозигота, клетка делится, и ее потомки наследуют признаки, полученные от донора и реципиента. Однако в других случаях поглощенные фрагменты ДНК разрушаются нуклеазами клетки-реципиента, и трансформации не происходит. Ее эффективность зависит также от размеров трансформирующей ДНК: высокомолекулярная ДНК поглощается труднее, чем менее крупные ее фрагменты. Способность к трансформации обнаружена у ряда родов бактерий, но, по-видимому, роль ее в обмене генетическим материалом среди бактерий в естественных условиях менее существенна, чем роль других механизмов. Дело в том, что у многих бактерий имеются особые системы рестрикции и модификации. Эти системы модифицируют свою ДНК (чаще всего путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК, если она подобным образом не модифицирована, с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз.

Эффективность метода генетической трансформации во много раз повышается в том случае, если смесь ДНК и трансформируемых клеток с помощью специального прибора подвергнуть обработке электрическим импульсом. Метод электротрансформации является универсальным, он применим к любым видам бактерий. С помощью этого метода осуществлена трансформация более 100 видов бактерий, и он может стать важным инструментом получения ценных рекомбинантных штаммов бактерий.

Трансфекция – вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой.

С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий (без клеточной стенки)

вирусную инфекцию. Трансфекцию можно осуществить и с другими (не бактериальными) клетками, если ввести в них чужеродную ДНК, способную рекомбинировать с ДНК этих клеток, или воспроизводить вирионы, или самостоятельно реплицироваться.

Трансдукция – перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую.

Неспецифическая трансдукция – случайный перенос фрагментов ДНК от одной бактериальной клетки к другой.

Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены.

Механизмы неспецифической и специфической трансдукции описаны в главе 47.

Конъюгация – это процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном (англ. transfer – перенос). Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения. Аппаратом переноса являются специальные донорные ворсинки, с помощью которых устанавливается контакт между конъюгирующими клетками. Донорные ворсинки представляют собой длинные (1 – 20 мкм) тонкие трубчатые структуры белковой природы с внутренним диаметром около 3 нм. Число донорных пилей у каждой F

-клетки невелико и, очевидно, соответствует числу копий конъюгативной плазмиды в клетке. Донорные ворсинки обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые, адсорбируясь на них, проникают в клетку и вызывают ее лизис. Для каждой группы конъюгативных плазмид существуют свои донорспецифические фаги. Ворсинки выполняют следующие функции: 1) с их помощью устанавливается контакт между донорной и реципиентной клетками; 2) они облегчают перенос нити ДНК (она, вероятно, протаскивается через ворсинку); 3) стягивают спаривающиеся клетки, что повышает эффективность конъюгации.

Процесс конъюгации протекает через следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом, протаскивание нити ДНК от донора к реципиенту, достройка перенесенной нити ДНК комплементарной ей нитью в реципиентной клетке и рекомбинация между переданной хромосомой (ее фрагментами) и хромосомой клетки-реципиента, размножение мерозиготы и образование клеток, несущих признаки донора и реципиента.

Сущность поверхностного исключения заключается в том, что под контролем traгенов синтезируются белки наружной мембраны, препятствующие (исключающие возможность) проникновению в клетку, несущую плазмиду, другой, но близкородственной ей плазмиды, или подавляющие конъюгативную репликацию ее ДНК.

Конъюгативная репликация переносимой нити хромосомной или плазмидной ДНК осуществляется также под контролем плазмидных генов. Классическим примером конъюгативной плазмиды является половой фактор, или F-плазмида (F – англ. fertility – плодовитость). Эта плазмида представляет собой двунитевую кольцевидную молекулу ДНК, состоящую из 94,5 тыс. п. н.

Главная функция этой плазмиды – контроль конъюгации у бактерий кишечной группы. Ее tra-оперон содержит больше тридцати генов, которые контролируют процесс конъюгации. Эта плазмида может как находиться в автономном состоянии, так и интегрироваться в хромосому клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос, при котором F

-клетка (клетка, лишенная F-плазмиды) превращается в F

-клетку (клетку, содержащую F-плазмиду). F-плазмида может интегрироваться в определенные участки бактериальной хромосомы, в этом случае она станет контролировать конъюгативный перенос хромосомы клетки. При этом одна из нитей ДНК хромосомы в месте интеграции F-плазмиды разрезается, и ее 5'-конец через донорный мостик начинает протягиваться в клеткуреципиент. Репликация ДНК в этом случае протекает по принципу «крутящегося кольца» (рис. 47). Таким образом, конъюгация начинается с установления контакта между донором и реципиентом с помощью донорной ворсинки. Последняя смыкается с рецептором клеточной мембраны клетки-реципиента. Нередко такой контакт устанавливается не только между двумя клетками, а между многими клетками, образуя агрегаты спаривания. Предполагают, что нить ДНК в процессе конъюгации протаскивается через канал донорной ворсинки. Поскольку донорный мостик является непрочным, процесс конъюгации может в любой момент прерваться. Поэтому при конъюгации может переноситься или часть хромосомы, или, реже, полная хромосома. С помощью F-плазмид частота переноса генов между бактериями существенно возрастает. Поэтому клетки, у которых F-плазмида интегрирована в хромосому, обозначают как клетки Hfr (Hfr – англ. high frequency recombination – клетки, обеспечивающие высокую частоту рекомбинаций).

Рис. 47. Конъюгационный перенос бактериальной ДНК

В некоторых случаях интегрированная в хромосому F-плазмида может из нее исключаться и, подобно умеренному фагу, «выхватывать» из хромосомы ее ген или даже целую группу генов. Такая плазмида, содержащая в своей ДНК часть генов хромосомы клетки, называется F'-плазмидой.

Сексдукция – перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F'-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции.

Глава 12

Генетические рекомбинации у бактерий