Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов – жирные кислоты, необходимы для роста некоторых стрептококков и микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим стеринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы B, входят в состав коферментов и или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав NAD и NADF, стафилококки и бруцеллы – в тиамине (B

), входящем в состав пирофосфата. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы – компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Метаболиты и различные ионы проникают в микробную клетку путем пассивной диффузии, облегченной диффузии, активного транспорта и при участии фосфотрансферазной системы (рис. 12). Два первых пути не требуют энергетических затрат. Облегченная диффузия протекает при участии ферментоподобных белков — пермеаз. Этими путями в клетку переносится ограниченное количество соединений. Большинство метаболитов, ионов и других веществ транспортируется в клетку активным путем с помощью специфических пермеаз, локализованных в цитоплазматической мембране. Данный процесс требует энергетических затрат и происходит даже в тех случаях, когда концентрация упомянутых соединений в среде ниже, чем в микробной клетке. При этом каждая пермеаза переносит в клетку только определенную аминокислоту или другое соединение. Фосфотрансферазная система состоит из ферментов I и Hpr, а также набора субстратов, осуществляющих фосфорилирование.

Рис. 12. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку:

Различная длина стрелок указывает на сдвиг равновесия. S – высокая, а s – низкая концентрация растворенных веществ; С – пермеазы; R – белок Hpr; R-ф – фосфо-Hpr; S-ф – фосфатная группа (по: Стейнер Р., 1979)

В процессе переноса может произойти химическая модификация вещества, например фосфорилирование углеводов при участии соответствующих ферментов.

Микроорганизмы синтезируют самые разнообразные ферменты (энзимы). Ферментный состав любого микроорганизма определяется его геномом и является достаточно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами бактерий, широко применяется для их идентификации. Вместе с тем многие ферменты (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза и др.) способствуют проявлению патогенных свойств у возбудителей некоторых инфекционных заболеваний, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты микроорганизмов локализуются в их цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве, другие выделяются в окружающую среду. На этом основано деление ферментов на экзо- и эндоферменты. Экзоферменты расщепляют макромолекулы в окружающей среде до более простых соединений, которые затем транспортируются в микробную клетку. Некоторые ферменты, локализованные в цитоплазме, функционируют независимо друг от друга, другие тесно связаны между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в определенной последовательности. Внутриклеточные ферменты, объединенные структурно и функционально, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране, составляют мультиферментные комплексы.

Ферменты, которые постоянно синтезируются в микробных клетках в определенных концентрациях, называют конститутивными. К ним относятся ферменты гликолиза. Ферменты, концентрация которых резко возрастает при наличии соответствующего субстрата, называют индуцибельными (индукция субстратом). К ним относятся ферменты транспорта и катаболизма лактозы – галактозидпермеаза; ?-галактозидаза и галактозидацетилтрансфераза; фермент, разрушающий пенициллин, – ?-лактамаза. В отсутствие субстрата они находятся в бактериальной клетке в следовых концентрациях, а при наличии соответствующего индуктора их количество резко возрастает.

Функциональная активность ферментов и скорость ферментативных реакций зависят от условий, в которых находится данный микроорганизм, и прежде всего от температуры и pH среды. Для многих патогенных микроорганизмов оптимальными являются температура 37 °C и pH 7,2 – 7,4.

3.4. Биосинтез углеводов, аминокислот и липидов

Микроорганизмы синтезируют моно-, олиго-, полисахариды и другие соединения, в состав которых входят углеводы. Автотрофы синтезируют глюкозу из углекислого газа (CO

) атмосферного воздуха. Гетеротрофы синтезируют глюкозу из углеродсодержащих соединений с длиной цепи C

– C

. В обоих случаях используются в основном реакции гликолиза, идущие в обратном направлении.

Большинство прокариот способны синтезировать все аминокислоты из пирувата. Источниками энергии являются молекулы АТФ. При образовании аминокислот азот вводится в молекулу предшественника на последних этапах биосинтеза при помощи реакций аминирования и переаминирования. Переход неорганического азота в органический происходит через ионы аммония, которые включаются в состав органических соединений. Только несколько аминокислот (L-аланин, аспартат и L-глутамат) образуются путем прямого аминирования, остальные – путем переаминирования.

Вместе с тем многие микроорганизмы могут получать аминокислоты из молекул белка, которые предварительно расщепляются ими с помощью протеаз и пептидаз. Образовавшиеся олигопептиды и аминокислоты переносятся в микробные клетки, где включаются в метаболические пути биосинтеза или подвергаются дальнейшему расщеплению. Ауксотрофные по некоторым аминокислотам прокариоты (ряд патогенных бактерий, микоплазмы, спирохеты) потребляют их в готовом виде в организме хозяина.

Липиды микроорганизмов представлены жирными кислотами, фосфолипидами, воском, терпенами, каротиноидами, которые содержат длинноцепочечные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.

Важную роль в биосинтезе жирных кислот у микроорганизмов играют так называемые ацилпереносящие белки. В ходе биосинтеза к ним присоединяются ацильные фрагменты с образованием тиоэфиров. Последовательное удлинение этих фрагментов приводит в конечном итоге к образованию высших жирных кислот, содержащих обычно 16 – 18 углеродных атомов.

Многие микроорганизмы синтезируют ненасыщенные жирные кислоты с двойными связями, которые формируются из соответствующих насыщенных кислот. У аэробов этот процесс требует присутствия кислорода. Микоплазмы получают жирные кислоты в готовом виде из клеток хозяина или из питательной среды.

Центральную роль в биосинтезе фосфолипидов играет цитидинфосфатглицерид, являющийся непосредственным предшественником фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита и фосфатидилглицерофосфата. Остальные фосфолипиды образуются путем ферментативных превращений этих соединений.

3.5. Рост и размножение микроорганизмов

Для роста и размножения микроорганизмов необходимы минеральные соединения, содержащие катионыNH

,K

,Mg

и др. Ионы аммония используются некоторыми бактериями для синтеза аминокислот, ионы калия – для связывания тРНК с рибосомами. Благодаря значительной внутриклеточной концентрации ионов калия в бактериальных клетках поддерживается высокое осмотическое давление. Ионы магния выполняют роль кофактора в ряде ферментативных процессов. Ионы трехвалентного железа входят в состав цитохромов и других гемопротеидов. Для ряда патогенных и условно-патогенных бактерий (эшерихии, шигеллы и др.) потребление трехвалентного железа в организме хозяина затруднено из-за нерастворимости его соединений при нейтральных и слабощелочных значениях pH. Некоторые микроорганизмы вырабатывают особые вещества — сидерофоры, которые связывают трехвалентное железо и делают его соединения растворимыми и транспортабельными. Бактерии активно ассимилируют анионы SO

иPO

для синтеза соединений, содержащих эти элементы (серосодержащие аминокислоты, фосфолипиды и др.).

Под термином рост следует понимать необратимое увеличение массы и размеров тела живых существ, для бактерий – увеличение количества клеток и клеточной массы.

Бактерии обычно размножаются бесполым путем – делением. Из одной клетки образуются две, каждая из которых делится в свою очередь. Такое деление при благоприятных условиях может продолжаться бесконечно долго. Вначале делится нуклеоид, затем между двумя будущими клетками образуется перегородка, состоящая из двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между этими двумя слоями появляется материал, из которого образуются два слоя клеточной оболочки. После расслоения клеточных оболочек клетки расходятся.

Грамположительные бактерии делятся посредством образования перегородки, вырастающей от клеточной стенки к центру. У микобактерий перегородка образуется внутри клетки, затем расщепляется на два слоя и разделяет клетку на две. Грамотрицательные бактерии, как правило, истончаются в центре и разделяются перегородкой на две клетки.

Скорость размножения микроорганизмов зависит от состава среды, температуры, условий питания, влажности и ряда других факторов. При благоприятных условиях многие бактерии делятся через 20 – 30 мин.

Недостаток пищи и накопление продуктов распада ограничивают скорость размножения. В проточной среде с непрерывно обновляющимся составом бактерии могут делиться каждые 15 мин. Скорость размножения различных видов бактерий неодинакова даже при наличии тождественных условий. Процесс размножения бактерий в свежей питательной среде включает в себя несколько этапов. Стационарная фаза – период задержки размножения. В этот период, который длится 1 – 2 ч, бактерии, внесенные в свежую питательную среду, не размножаются. Лаг-фаза – приспособление бактерий к новой среде и к последующему размножению в ней. К концу лаг-фазы объем клеток увеличивается. Длительность лаг-фазы зависит как от внешних условий, так и от возраста бактерий и их видовой специфичности. Лаг-фаза развития – время интенсивного логарифмического или экспоненциального размножения. В данный период размножение бактерий идет с максимальной скоростью, а число клеток увеличивается в геометрической прогрессии.

За этими фазами наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий вследствие истощения источников энергии, накопления продуктов метаболизма и других факторов.

Культура бактерий в ограниченном объеме питательной среды называется периодической, и описанные фазы роста характерны именно для таких культур. Если благоприятные для роста бактерий условия поддерживать путем подачи свежей питательной среды и оттока продуктов распада, то их культивирование станет непрерывным. Это происходит при различных биотехнологических процессах.

По типу дыхания риккетсии являются аэробами. Их характерными метаболическими признаками являются: полное окисление глутаминовой кислоты и отсутствие утилизации глюкозы. Риккетсии имеют белковые эндотоксины, чувствительные к формалину.

Рис. 13. Колонии микоплазм

Риккетсии размножаются путем обычного деления кокковидных и палочковидных форм с последующей фазой гомогенных популяций. Другой формой размножения является мицеллярное (как у грибов) дробление нитевидных форм. Нитевидные формы соответствуют наиболее ранней фазе развития риккетсий, а кокковидные и короткие палочковидные формы представляют конечную стадию их деления. Риккетсии размножаются гораздо медленнее, чем бактерии.

Размножение микоплазм не может происходить без участия стерола. Хотя микоплазмы и могут расти на искусственных питательных средах, для своего роста они нуждаются также в холестерине, жирных кислотах и нативном белке. Микоплазмы проникают через водную пленку и адсорбируются агаром. Через 18 ч внутри агара формируются маленькие сферические колонии, через 48 ч эта колония достигает поверхности водной пленки агара. Внешние колонии микоплазм имеют вид яичницы-глазуньи (рис. 13).

Хламидии существуют в двух формах, различающихся по морфологическим и биологическим свойствам. Инфекционной внеклеточной формой является элементарное тельце (ЭТ), а вегетативной, репродуцирующейся, внутриклеточной – ретикулярное тельце (РТ). Элементарное тельце имеет вид сферы диаметром 0,15 – 0,2 мкм, ретикулярное – имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий размером около 1 мкм (рис. 14). В ЭТ содержится больше дисульфидных связей, что позволяет им противостоять осмотическому давлению.

Первый этап инфекционного процесса – адсорбция ЭТ на плазмалемме клетки-хозяина. Важную роль здесь играют электростатические силы. Внедрение хламидий происходит путем эндоцитоза. Инвагинация участка плазмалеммы с адсорбированным ЭТ происходит в цитоплазму с образованием фагоцитарной вакуоли. Эта фаза занимает 7 – 10 ч, затем в течение 6 – 8 ч происходит реорганизация ЭТ в вегетативную форму – ретикулярное тельце, способное к росту и делению. Именно в этой фазе эффективно применение антибактериальных препаратов, поскольку ЭТ к ним не чувствительно.

Рис. 14. Цикл размножения хламидий (стадии развития от попадания ЭТ в клетку до выхода ЭТ следующего поколения):

1 – адсорбция элементарного тельца; 2 – проникновение элементарного тельца в клетку; 3 – реорганизация элементарного тельца в ретикулярное тельце; 4 – деление ретикулярного тельца; 5 – созревание ретикулярных телец в элементарные; 6 – накопление ретикулярных телец в эндосоме; 7 – выход хламидий из клетки

Размножение хламидий приводит к формированию включений, известных под названием телец Провачека. В течение 18 – 24 ч развития они локализованы в цитоплазматическом пузырьке, образованном из мембраны клетки-хозяина. Во включении может содержаться от 100 до 500 хламидий. Остановка процесса на этой стадии ведет к персистенции хламидийной инфекции. Далее начинается процесс созревания ретикулярных телец через переходные (промежуточные) тельца в течение 36 – 42 ч развития в ЭТ следующего поколения. Полный цикл репродукции хламидий равен 48 – 72 ч и завершается разрушением пораженной клетки. В случае возникновения для хламидий неблагоприятных метаболических условий этот процесс может затягиваться на более длительный период.

Хламидии могут высвобождаться из инфицированной клетки через узкий ободок цитоплазмы. При этом клетка может сохранять жизнеспособность, этим можно объяснить бессимптомность течения хламидийной инфекции.

Рис. 15. Артроспоры культуры гриба Trichosporon beigelii

Грибы размножаются как половым, так и бесполым (вегетативным) способом. Последний осуществляется с помощью простого митоза. Основные способы размножения:

1) фрагментация гифов мицелия грибов, в результате чего образуются артроспоры (рис. 15); если они образуют толстостенную оболочку, то называются хламидоспорами, высокоустойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды;