Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

Диаметр споры равен приблизительно диаметру клетки, в которой она образовалась, или несколько превышает его. У некоторых бактерий спора формируется на конце клетки, которая при этом несколько расширяется и приобретает вид барабанной палочки. У других бактерий спора образуется в центре клетки, которая либо не меняет формы (род Bacillus), либо в середине расширяется и принимает вид веретена (род Clostridium). Вегетативная часть клетки разрушается и исчезает, и остается только преломляющая свет спора, с трудом подвергающаяся окрашиванию.

Попадая в благоприятные условия, спора начинает «прорастать». При этом она разбухает не только в результате поглощения воды, но и вследствие роста клетки за счет резервного материала. Затем оболочки под влиянием давления, вызванного ростом, разрываются и дают трещину. Возникает новая вегетативная клетка. Способ, которым клетка выходит из споры, индивидуален для каждого вида и может использоваться в качестве видовой характеристики.

Благодаря жесткости стенки клетка сохраняет форму: шаровидную, палочковидную или извитую. Оболочка защищает клетку, сохраняя ее структурную целостность при изменении внешних условий, в частности при осмотических воздействиях. Наряду с мембраной она служит полупроницаемым барьером, обеспечивающим избирательное проникновение питательных веществ из окружающей среды и выделение высокомолекулярных соединений – токсинов или ферментов, участвующих во внеклеточном переваривании субстратов. Клеточная стенка определяет антигенную специфичность видов, является местом адсорбции фагов на клетке и участвует в процессах движения и деления.

При изучении химического состава клеточных стенок грамположительных (бактерий с толстой клеточной стенкой) и грамотрицательных бактерий (с тонкой клеточной стенкой) выявились существенные различия в их качественном и количественном составе (рис. 7).

Рис. 7. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий (А) и грамположительных (Б) (по: Поздеев О. К., 2001)

За механическую прочность стенки у этих групп микроорганизмов ответствен один и тот же гетерополимер — пептидогликан, вместе с тем его количественное содержание и локализация у разных бактерий не одинаковы. А такой компонент клеточной стенки, как тейхоевые кислоты, содержится в стенках только грамположительных бактерий. Электронномикроскопическое изучение срезов поверхностных слоев грамположительных и грамотрицательных бактерий также подтвердило неоднородность структуры их клеточных стенок.

Грамположительные (толстокожие) бактерии

Стенка грамположительных бактерий представляет собой однородную структуру толщиной приблизительно 20 – 80 нм. Главный ее компонент – пептидогликан – составляет 40 – 90 % от сухой массы стенки. Это универсальный гетерополимер. С ним ковалентно связаны полисахариды и тейхоевые кислоты. Он найден в клеточных стенках почти всех прокариотических клеток.

Жесткий слой пептидогликана окружает всю бактериальную клетку и является по существу одной крупной «мешковидной» молекулой. Молекула пептидогликана представляет собой параллельные полисахаридные цепи, связанные между собой короткими пептидными мостиками. Повторяющейся единицей полисахаридных цепей является муропептид. Таким образом, молекула пептидогликана – это замкнутая со всех сторон сеть, окружающая бактериальную клетку.

Структура пептидогликанового слоя обусловливает основные функции клеточной стенки – формообразующую и защитную.

Пептидогликан в клеточных стенках грамположительных бактерий ковалентно связан с полисахаридами особого типа – тейхоевыми кислотами. Эти растворимые в воде полимеры представляют собой длинные цепи, состоящие из остатков глицерина и рибита, связанных друг с другом фосфодиэфирными мостиками. Эти соединения могут составлять до 50 % массы сухих стенок. Из клеточных стенок бактерий были выделены два типа тейхоевых кислот: рибиттейхоевая, состоящая из остатков рибитфосфата, и глицеринтейхоевая, состоящая из остатков глицерофосфата. Небольшое количество глицеринтейхоевой кислоты ковалентно связано с мембранными гликолипидами. Это соединение называют липотейхоевой, или мембранной тейхоевой, кислотой. Клеточные стенки каждого штамма содержат кислоту только одного типа.

Значительная часть тейхоевых кислот располагается между клеточной мембраной и слоем пептидогликана. Связь тейхоевых кислот с пептидогликаном осуществляется путем образования фосфодиэфирной связи. Выступая на поверхности клетки, тейхоевые кислоты создают в ее оболочке высокую плотность регулярно ориентированных зарядов, способствуя проникновению ионов через внешние слои.

Кроме пептидогликана и тейхоевых кислот клеточные стенки грамположительных бактерий содержат также сопутствующие полисахариды – гликозамин, глюкозу, арабинозу, маннозу и (или) рамнозу. Тейхоевые кислоты и полисахариды клеточных стенок обладают антигенной активностью.

Липиды в стенках грамположительных бактерий содержатся в очень небольшом количестве или отсутствуют вовсе. В основном это длинноцепочечные жирные кислоты, соединенные сложноэфирными связями с полисахаридами стенки. Белки в клеточных стенках этой группы бактерий содержатся не всегда. Если они обнаруживаются, то связаны с внешней мембраной.

Грамотрицательные (тонкокожие) бактерии

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий устроена сложнее, чем грамположительных. Она состоит из трех слоев: наружного – липопротеинового, среднего – липополисахаридного и внутреннего – пептидогликанового (ригидного).

Внутренний пептидогликановый слой тонкий (2 – 3 нм). Его содержание в клеточной стенке невелико – всего 5 – 10 % от массы сухого вещества стенки. Грамотрицательные бактерии пептидогликана отличаются от грамположительных низким содержанием поперечных сшивок и меньшим разнообразием диаминокислот. Пептидогликановый слой стенки может быть выделен в виде очень тонкого мешочка, сохраняющего форму и размеры исходной клетки.

Поверх тонкого пептидогликанового мешка располагается более толстый слой (8 – 10 нм), состоящий из липополисахаридов, белков и фосфолипидов, тонкая структура которого мало отличается от цитоплазматической мембраны.

Липополисахариды – главные компоненты внешнего слоя стенки. Они представляют собой сложную молекулу – «скелет» (липид А) и прикрепленный к нему полисахарид, образованный ядром и терминальной цепью повторяющихся единиц. У всех грамотрицательных бактерий ядро полисахарида имеет одинаковую структуру. Вариабельной частью являются повторяющиеся единицы – трисахариды либо разветвляющиеся тетра- или пентасахариды. Эти длинные боковые цепи выступают над поверхностью клетки, образуя так называемый «молекулярный ворс», и служат рецепторами для адсорбции многих фагов. Липополисахариды являются главными антигенными детерминантами клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

Риккетсии – полиморфные грамотрицательные бактерии (рис. 8, см. цв. вклейку). Термин «риккетсия» впервые применил длиной до в 1916 г. бразильский микробиолог Э. да Роха-Лима в память Г. Риккетса, который, изучая сыпной тиф, заразился и трагически погиб. Большой вклад в изучение риккетсий внесли отечественные ученые: О. О. Мочутковский, П. Ф. Здродовский, Е. М. Голиневич и К. Н. Токаревич. По морфологическим признакам выделяют несколько форм риккетсий:

1) кокковидные – овал или эллипсоид диаметром 0,5 мкм, возможно образование диплоформ (гантелей), цепочек, конгломератов, в ряде случаев обнаруживается зернистость;

2) палочковидные образования длиной до 1 – 1,5 мкм с зернистостью на концах;

3) удлиненные, изогнутые, тонкие образования 3 – 4 мкм;

4) нитевидные (мицеллярные) формы длиной 10 – 40 мкм и более, иногда это зернистые изогнутые нити.

Доказана способность риккетсий образовывать фильтрующиеся формы. Риккетсии не образуют спор, имеют микрокапсулу, не обладают подвижностью.

Исследование риккетсий с применением электронной микроскопии и цитохимических методов показало, что микроорганизмы имеют две оболочки – внешнюю (выполняет функции клеточной стенки, состоит из трех слоев) и внутреннюю (толщиной 6 нм). В цитоплазме обнаружены гранулы величиной 20 – 70 нм и вакуоли диаметром 6 – 8 нм.

Риккетсии размножаются в эндотелиальных клетках капилляров, что приводит к закупорке сосудов и появлению сыпи.

Для риккетсий характерно большое содержание нуклеиновых кислот – как ДНК, так и РНК, что сближает их с бактериями. В теле риккетсий обнаружено большое количество липидов и мало углеводов, что характерно для вирусов.

Во внешней среде риккетсии малоустойчивы и сохраняются в организме членистоногих – клещей, блох и вшей. Исключением является возбудитель ку-лихорадки, который при низких температурах сохраняется во внешней среде около года.

Риккетсии являются внутриклеточными паразитами, поэтому не способны расти и размножаться на бесклеточных средах и мертвых тканевых субстратах. Особенностью риккетсий является их оптимальное размножение в живых тканях и клетках при температуре 35…36 °C. Однако уже при 40 °C рост и размножение риккетсий угнетается.

Рис. 9. Электронная микрофотография микоплазм

Особенности внутриклеточного паразитизма риккетсий следует рассматривать, исходя из места их локализации в инфицированной клетке. Некоторые риккетсии размножаются в цитоплазме (возбудители эпидемического и эндемического сыпных тифов и ку-лихорадки). Риккетсии – возбудители клещевых лихорадок – размножаются и в цитоплазме, и в ядре.

Микоплазмы – мелкие самореплицирующиеся грамотрицательные бактерии (прокариоты). Название «микоплазмы» было предложено в 1929 г. К. Новаком, оно подчеркивало их пластичность.

Микоплазмы относятся к классу Mollicutes («мягкокожие»).

При световой микроскопии в окрашенном по методу Романовского – Гимзы препарате видны полиморфные клетки – глобулы различной величины, зерна, иногда нити. При фазовоконтрастной микроскопии определяется гетерогенность популяции не только по величине, но и по оптической плотности отдельных клеток. Диаметр клеток 0,3 – 0,8 мкм (рис. 9). Иногда грушевидные, гантелевидные, ветвящиеся формы могут достигать 100 – 150 мкм либо встречаются в виде элементарных телец – гранул размером всего 0,1 – 0,25 мкм.

Такая полиморфность обусловлена отсутствием клеточной стенки, что качественно отличает их от остальных бактерий. Вместо клеточной стенки микоплазмы покрыты трехслойной цитоплазматической мембраной.

У бактерий под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды (при применении антибиотиков, действующих на клеточную стенку) может возникать обратимое состояние L-формы. Клетка микоплазм очень просто организована, она содержит минимальное количество органелл: цитоплазму, рибосомы, циркулярную двунитчатую ДНК, мембранные внутриплазматические структуры и дополнительные органоиды. Мембрана составляет 15 % от массы всей клетки. На ее наружном слое выявляется капсулоподобный слой из полисахаридов. Он играет защитную и адсорбционную роль. Толщина капсулы 20 – 125 нм.

Цитоплазма содержит протеины, липиды, углеводы, РНК и ДНК.

Из дополнительных органелл выделяют сеть фибрилл, расположенных под цитоплазматической мембраной и прикрепленных к ее внутреннему слою. Эти белки выполняют функцию цитоскелета. Есть микроворсинки и терминальные структуры на одном из полюсов клетки – нити с заостренными концами длиной в клетку микоплазмы, которые обеспечивают некоторую скользящую подвижность и адгезию.

Полиморфизм тесно связан с репродукцией микоплазм. Для них характерно как равновеликое, так и неравномерное деление материнской клетки. Возможно также сегментирование цитоплазмы на несколько клеток с образованием в итоге мицеллярной структуры, из которой затем формируются сферические тела.

Новые особи могут возникать и в результате отпочковывания их от поверхности материнской клетки.

Жизненный цикл и метаболизм микоплазм зависит от клетки-хозяина, с которой они тесно связаны. Они персистируют и паразитируют на мембранах эукариотических клеток. Отдельные виды приобрели тропизм к определенной ткани.

Микоплазмы высокоустойчивы к действию низких температур. При температуре от –20 до –65 °C большинство бульонных культур сохраняют жизнеспособность в течение 12 мес., при температуре 4 °C – около 1,5 мес. Применение 50 %-ного глицерина в питательной среде резко увеличивает сроки их жизнеспособности. Устойчивость микоплазм к более высоким температурам зависит от состава среды, в которой они находятся. В средах с повышенным содержанием белка их устойчивость возрастает.

Микоплазмы чувствительны к изменению рН среды в щелочную сторону. При рН > 7,5 их жизнедеятельность резко угнетается.

Хламидии – мелкие грамотрицательные кокковидные микроорганизмы размером 0,25 – 1 мкм. По своим основным признакам они отнесены к бактериям, так как содержат два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), рибосомы, мурамовую кислоту (компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий), размножаются бинарным делением и даже чувствительны к некоторым антибиотикам. Ранее хламидии относили к крупным вирусам. В отличие от бактерий они не растут на искусственных питательных средах, их культивируют в желточном мешке куриных эмбрионов и тканевых культурах так же, как и вирусы. Кроме того, хламидии являются строгими внутриклеточными паразитами и размножаются в основном в цитоплазме клеток человека. Хламидии помещены в одну таксономическую группу с риккетсиями, с которыми их объединяет внутриклеточный паразитизм.

Рис. 10. Структура клеточной стенки хламидий

Структура клеточной стенки хламидий соответствует общему принципу построения грамотрицательных бактерий (рис. 10). Она состоит из внутренней цитоплазматической и наружной мембран (обе являются двойными, обеспечивая прочность клеточной стенки). Антигенные свойства хламидий определяются внутренней мембраной, которая представлена липополисахаридами (LPS). В нее интегрированы так называемые белки наружной мембраны (Outer membrane proteins – OMP). На основной белок наружной мембраны – Maior Outer Membrane Protein (МОМР – элементарное тельце) приходится 60 % от общего количества белка. Оставшаяся антигенная структура представлена белками наружной мембраны второго типа – ОМР-2.

Длительное время считалось, что хламидии имеют характерный дефект ряда ферментных систем и не способны самостоятельно окислять глутамин и пируват, а также осуществлять фосфорилирование и эффективное окисление глюкозы. Ранее также предполагалось, что хламидии являются облигатными внутриклеточными энергетическими паразитами, использующими метаболическую энергию эукариотической клетки в виде АТФ и других макроэргических соединений. В настоящее время анализ генома показал, что хламидии способны синтезировать АТФ, хотя и в незначительных количествах, путем гликолиза и расщепления гликогена. У хламидий отсутствует пептидогликан – компонент клеточной стенки, существующий как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий, но при этом в геноме содержатся гены, кодирующие белки, которые необходимы для его полного синтеза. Предполагается, что синтезируемые пептидогликан или пептидогликановый компонент имеют функции, отличные от функций других бактерий.

Методом сканирующей электронной микроскопии на поверхности хламидий были выявлены куполообразные структуры, пронизанные микрофиламентами. Функцию этой структуры связывают с транспортом питательных веществ от эукариотической клетки к паразиту. Обнаружение в геноме хламидий генов, кодирующих аппарат для III типа секреции, который обусловливает вирулентность грамотрицательных бактерий, позволило предположить, что это образование осуществляет передачу сигнала от паразита к эукариотической клетке.

2.2. Грибы