Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

• определенность изменчивости (определенный фактор внешней среды, условий вызывает изменение строго определенного признака);

• общность изменений (изменения признака одновременно у всех или большинства особей генетически однородной популяции);

• обратимость изменений (изменения не наследуются и после прекращения действия внешнего фактора исчезают).

Рассмотрим пример модификационной изменчивости бактерий. При посеве разведенной культуры протея (Proteus vulgaris) на питательный агар через сутки выросли колонии бактерий, каждая из которых окружена зоной роения. После пересева колоний на питательный агар с желчью все колонии выросли через сутки без роения. После пересева этих колоний на исходный питательный агар все выросшие колонии вновь имели зоны роения.

Изменения фенотипа протея на среде с желчью следует считать модификацией, так как при этом присутствуют все три вышеперечисленные отличительные признака.

Возможность модификационной изменчивости бактерий следует постоянно учитывать в практической работе микробиолога. Для точной систематики и идентификации бактерий следует строго соблюдать стандартные (унифицированные) условия изучения их свойств (питательные среды, тесты, реактивы, температуру и другие условия культивирования). Огромное значение в связи с этим приобретают квалификация и опыт лаборанта.

Наследственная изменчивость

Первоисточником новых генов в природе является мутация (лат. mutatio – изменение генетических структур, имеющихся в клетке в данный момент, которое стабильно наследуется). Различают две группы мутаций: хромосомные аберрации, включающие в себя три типа (изменение числа наборов хромосом, изменение числа отдельных хромосом, перестройки хромосом), и генные мутации. У бактерии могут быть мутации типа перестройки хромосом и генные мутации. При этом перестройки хромосом осуществляются путем делений (выпадения фрагмента хромосомы), инверсии (поворота участка хромосомы на 180°), транспозиций (вставок в какое-либо место хромосом небольших фрагментов ДНК, например инсерционных сегментов или транспозонов).

Генные мутации бывают односайтовые (в одном участке гена) и многосайтовые. Для появления мутации в гене достаточно точечного изменения одной пары нуклеотидов. По направлению мутации делятся на прямые и обратные. Прямые мутации вызывают изменения признаков организма дикого типа; обратные мутации сопровождаются реверсией к дикому типу. Восстановление исходного фенотипа в результате обратной мутации в ином участке гена или в другом гене является супрессорной мутацией. Мутация, в результате которой изменяются два и более признаков организма, называется плейотропной. Различают также спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в том смысле, что они детерминированы, но мы не знаем конкретно их причин. Индуцированные мутации вызываются воздействием определенных мутагенных факторов. К ним относятся различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовые лучи, химические мутагены.

Изменчивость по механизму мутаций характеризуется определенными отличительными признаками, к числу которых относятся:

1. Наследственность.

2. Низкая частота (скорость) мутирования (у бактерий 1 ? 10

– 1 ? 10

, т. е. мутация у одной клетки из 1 – 10 миллионов). Способность к мутациям (мутабельность) подвержена влиянию генотипа. У бактерий мутабельность резко повышается при наличии особых генов – мутаторов. Например, у кишечной палочки обнаружены два гена-мутатора – mut T, mut SI.

3. Ненаправленность изменчивости (неопределенность, неадекватность изменения признаков виду воздействующего фактора; один и тот же фактор вызывает различные мутации).

Другим механизмом наследственной изменчивости является обмен генетическим материалом между клетками популяций бактерий (по горизонтали). Он не создает новых элементарных признаков, но ускоряет создание организмов с новыми комбинациями признаков за счет перераспределения генов из разных геномов, способствуя быстрому приспособлению бактерий к условиям среды. Различные виды и роды бактерий способны к широкому генетическому обмену между собой, а также с бактериофагами и плазмидами. У бактерий выявлены три основные формы обмена генетическим материалом: трансформация, трансдукция, конъюгация. Они различаются способом передачи генетического материала.

Под трансформацией подразумевают процесс передачи клетке-реципиенту некоторых генов донора с помощью свободной ДНК, выделенной из генома донора. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Спонтанная трансформация в естественных условиях проявляется в появлении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду при их разрушении или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами.

Индуцированная (искусственная) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из бактерий-доноров.

Для успешной трансформации необходим ряд условий, относящихся к ДНК и бактериям-реципиентам. ДНК должна быть двуцепочечной, иметь фрагменты массой 3 – 5 ? 10

Д, быть частично или полностью гомологичной ДНК реципиента. Клетки реципиента должны обладать компетентностью, т. е. восприимчивостью, что имеет место только в определенный период жизненного цикла и обусловлено выделением клеткой особого белка «фактора компетентности» и специфическим изменением проницаемости клеточной стенки и мембраны.

Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: связывания ДНК на поверхности компетентного реципиента с «фактором компетентности», проникновения ДНК путем «втаскивания» в клетку, включения ДНК в хромосому бактерии-реципиента путем рекомбинации, экспрессии переданных генов. Эффективность генетической трансформации во много раз повышается, если смесь ДНК и трансформируемых клеток подвергнуть обработке электрическим импульсом (метод электротрансформации). В естественных условиях эффективность трансформации менее существенна по сравнению с другими формами передачи генетического материала. Клетки бактерий имеют механизм защиты генома от чужеродной ДНК – особые системы модификации и рестрикции. Эти системы защищают свою ДНК путем модификации (чаще путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз. Частным вариантом трансформации является трансфекция, когда в клетку-реципиент, лишенную клеточной стенки, вносят ДНК бактериофага или плазмид.

Трансдукция — перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают общую (неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Механизм общей трансдукции состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения вирулентного фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равной по длине фаговой. Так возникают дефектные фаги, у которых вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии-донора. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, но при этом размножения фага не происходит. В случае генетической рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки-реципиента новый признак наследственно закрепляется. Таким образом, при общей трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала.

Специфическую трансдукцию отличает перенос строго определенного фрагмента ДНК бактерии-донора умеренными бактериофагами. Как известно, умеренными называют такие бактериофаги, которые могут интегрировать в хромосому клетки бактерий, вызывая ее лизогенизацию. Под термином «лизогенизация» следует понимать способность различных штаммов бактерий, содержащих бактериофаги, лизировать, или растворять, другие штаммы бактерий, при этом не разрушаясь. Интегрированный в хромосому бактерии-донора умеренный фаг (профаг) в определенных условиях выходит из хромосомы, захватывая ближайшие участки ДНК хромосомы бактерии и оставляя часть своего генома. Возникает дефектный умеренный фаг, включивший в свой геном бактериальные гены бактерии-донора. Далее трансдуцирующий фаг вносит свою ДНК в клетку бактерии-реципиента, где она вместе с фрагментом ДНК бактерии-донора интегрируется в состав хромосомы реципиента. Впоследствии фаг может выйти из хромосомы реципиента, но переданные им гены бактерии-донора остаются у реципиента. Примером может служить умеренный бактериофаг лямбда ( ), который всегда переносит оперон gal или оперон bio. Специфическая и общая трансдукции низкочастотны (10

– 10

на 1 частицу фага).

Частным вариантом специфической трансдукции является фаговая, или лизогенная, конверсия. Трансдуцирующий фаг, интегрируясь в хромосому реципиента, вызывает лизогенизацию бактерии и передает гены новых признаков, например токсинообразования, дифтерийным бактериям. Однако гены, контролирующие новый признак, постоянно включены в геном таких трансдуцирующих фагов. Появление этих генов не связано с предварительным размножением фага на токсигенных донорах. Вероятно, фаг включил в геном эти гены на более ранних этапах своей эволюции. Такие трансдуцирующие фаги не дефектны и вызывают фаговую конверсию с очень высокой частотой.

Конъюгация характеризуется переносом генетического материала путем непосредственного контакта между клетками. Этот процесс полярен – генетический материал передается только от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам. Донорская функция клетки и процесс конъюгации контролируются генами конъюгационного переноса (tra-оперон), локализованными в конъюгативных плазмидах. Среди многих конъюгативных плазмид имеется плазмида F, контролирующая только указанные функции. В автономном, внехромосомном, состоянии она обеспечивает донорский тип клетки F+ (мужская), образование полых ворсинок (F-пили) и свой собственный перенос в F–(женские) клетки реципиента. При этом хромосома донора не передается, а реципиенты, получившие плазмиду F, приобретают донорский тип F+. При интеграции плазмиды F в хромосому бактерии-хозяина образуются Hfr (high frequency of recombination) – штаммы бактерий с высокой частотой передачи хромосомных генов. Однако плазмида F обычно не переходит в клетку реципиента, так как находится на конце хромосомы, противоположном тому, с которого начинается ее переход.

Переход хромосомы через конъюгационный мостик между клетками через канал F-пили сопряжен с ее репликацией. При этом через мостик проходит только одна нить ДНК хромосомы, на которой в клетке реципиента синтезируется комплементарная вторая нить, и далее под контролем генов рекомбинации (rec A) хромосомы реципиента переданный фрагмент ДНК интегрирует в хромосому реципиента. Плазмида F может возвращаться у Hfr-штаммов в исходное внехромосомное состояние, захватив прилегающий участок бактериальной хромосомы. Таким способом формируется плазмида F? (F-прим), несущая часть хромосомных генов бактерии-хозяина, например плазмида F’lac.

Перенос генов донора в клетки реципиентов посредством плазмид F’ называется сексдукцией. При этом плазмида F’ переносит свой геном, содержащий и некоторые гены донора, с высокой частотой, а хромосома бактерии-донора не передается. Другие виды конъюгативных плазмид (R, Ent, Col и др.) также переносятся с высокой частотой. Следует отметить, что эффективный перенос плазмид путем конъюгации не знает «родственных» барьеров и происходит между бактериями различных видов и родов.

При любой форме обмена генетическим материалом заключительным этапом является рекомбинация между полученной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. При переносе одной нити ДНК вначале происходит достраивание комплементарной ей нитью. Рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Известны общая, сайт-специфическая рекомбинация и рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы E. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном rec A. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от rec A гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену rec A. Его продукт – белок Rec A (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Ген rec A участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена rec A. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК, поэтому ген rec A играет основную роль в самозащите генетической системы бактерий.

5.4. Прикладные аспекты генетики микроорганизмов

Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки для разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК выявляет уровень гомологии ДНК. Считается, что показатель 60 – 100 % гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства.

Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК, выявляющий последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим (наиболее консервативным) объектом исследования является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК является основным в геносистематике; он позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно эффективен для установления вида. Этот метод также помогает установить эволюционные связи бактерий.

Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий. Установлено, что основную роль в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам играют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор не существует эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Это позволяет выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением в области генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний – геноиндикация. Метод ПЦР позволяет клонировать in vitro определенные участки ДНК, за 2 – 4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа: тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров) и синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при температуре 90 – 95 °C в течение 40 – 50 с. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40 – 65 °C.

Праймеры – синтетические олигонуклеотиды (20 – 30 нуклеотидов) – присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой – на противоположной. Синтез (элонгация) – достраивание второй цепи ДНК происходит при температуре 72 °C с участием Taq-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5?-конца к 3?-концу каждой нити ДНК, т. е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет 30 – 40 с. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 21). Обычно ПЦР включает 20 – 30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 21. Схема полимеразной цепной реакции. Сплошной линией показана исходная ДНК, пунктирной – вновь синтезированная

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез в 1,5 – 3 %-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. По окончании электрофореза гель просматривают в УФ-свете на трансиллюминаторе и оценивают результаты.

Метод ПЦР позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 ? 10

– 1 ? 10

микроорганизмов в 1 г материала). Он широко применяется для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм и микобактерий).

В лабораторной практике для индикации и идентификации микроорганизмов используют также метод ДНК-зондов, являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Его отличие от последнего заключается в том, что гибридизация ведется не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментами ДНК-зонда (обычно в пределах известного гена) и всей ДНК изучаемого микроорганизма. ДНК-зонды метят изотопами или нерадиоактивной меткой (биотином).

Важное значение в эпидемиологической практике имеют методы внутривидового генетического маркирования штаммов бактерий. К ним относится метод геномной дактилоскопии, или фингерпринтинг (англ. fingerprinting – снятие отпечатков пальцев). Сущность его состоит в рестрикционном анализе ДНК. Очищенную ДНК исследуемого микроорганизма обрабатывают соответствующей специфической эндонуклеазой (рестриктазой), полученные фрагменты ДНК разделяют путем электрофореза в геле. Для каждого исследуемого штамма на электрофореграммах (рестриктограммах) образуется паттерн с характерным набором полос. Число фрагментов, их размер и общая картина расположения специфичны для каждого микроорганизма, как отпечатки пальцев. Сравнивая рестриктограмму контрольного (известного) штамма с рестриктограммой исследуемого штамма, можно определить их тождество или различие. Вариантом метода является риботипирование, когда рестрикции подвергаются участки ДНК, кодирующие рРНК. Метод геномной дактилоскопии позволяет дифференцировать родственные бактерии на внутривидовом уровне.

5.5. Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии

Выдающимся достижением генетики и микробиологии является создание генной инженерии. Генной инженерией называют прикладную генетику, которая разрабатывает методы целенаправленной перестройки геномов и их генетической информации на молекулярном и клеточном уровнях. Она включает в себя совокупность приемов, позволяющих перенести генетический материал из одного организма в другой таким образом, чтобы обеспечить наследование и экспрессию перенесенных генов. Применительно к бактериям генная инженерия использует трансгеноз, то есть искусственный перенос генов (обычно генов эукариот) в клетку бактерий.

Трансгеноз состоит из трех этапов: 1) выделения гена, подлежащего переносу; 2) включения гена в вектор, т. е. в автономно реплицирующуюся генетическую структуру, с помощью которой гены могут быть размножены и введены в клетку-реципиент; 3) передачи вектора с чужеродными генами в клетку-реципиент, где чужеродные гены клонируются (размножаются) в составе хромосом или автономных репликонов и обеспечивают синтез необходимых веществ.

Первый этап. Его задачей является перенос генов эукариот (человека, животных), контролирующих синтез необходимых веществ (гормонов, ферментов) в геном бактерий. Для преодоления генетического барьера между эукариотами и прокариотами предварительно in vitro получают на матрице зрелой информационной РНК соответствующей локализации в ДНК нужного гена с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) копийную ДНК (к-ДНК), содержащую ген с нужной информацией. Необходимый ген выделяют из к-ДНК с помощью специфических ферментов рестриктаз (эндонуклеаз). Рестриктазы распознают и разрезают строго определенные участки ДНК так, чтобы срез каждой нити проходил «косо» – на вырезанном двунитевом фрагменте ДНК на концах остаются однонитевые участки («липкие концы»).

Второй этап. Этим же видом рестриктаз обрабатывают молекулы вектора, чтобы перевести их кольцевые структуры в линейные и в местах разреза получить «липкие концы», соответствующие «липким концам» ДНК переносимого гена. В качестве вектора обычно используют R-плазмиды, фаг лямбда. Затем смешивают фрагменты ДНК с нужным геном и ДНК разрезанного вектора. При этом ДНК с нужным геном «липкими концами» встраивается в геном вектора. Места прикрепления гена сшиваются ферментом лигазой. Таким образом получается гибридная молекула вектора с нужным чужеродным геном.