Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

Третий этап. Вектор вводится в клетки бактерий-реципиентов, где он клонируется (реплицируется), передается из клетки в клетку при делении, а чужеродный ген экспрессируется, обеспечивая синтез необходимого продукта. В качестве бактерий-реципиентов чаще всего используют кишечную палочку (рис. 22).

Рис. 22. Схема получения трансгенных клеток E. coli – продуцентов интерферона человека (по: Шапиро Я. С., 2003):

мРНК – интерфероновая мРНК из клеток человека; кДНК1 – комплементарная однонитевая ДНК; кДНК2 – комплементарная двунитевая ДНК; рВR322 – плазмидный вектор; 1 – обратная транскриптаза; 2 – полимераза; 3 – лигаза; 4 – плазмида с геном интерферона; 5 – трансформация; 6 – клетка кишечной палочки с реконструированной плазмидой

Генная инженерия впервые дала возможность человеку управлять наследственностью. Так возникла биотехнология — промышленный способ производства на основе управляемого метаболизма живых организмов. В настоящее время происходит бурное развитие биотехнологии, основным объектом которой являются микроорганизмы. Именно микроорганизмы (бактерии, грибы) благодаря особенностям их метаболизма наиболее продуктивны и экономичны в биосинтезе веществ. Микроорганизмы поставляют также материал для генной инженерии (ревертазу, эндонуклеазы, векторы для генов). Из бактерий получают в большом количестве дешевые биологически активные вещества (гормоны, ферменты), которые ранее были дефицитными и очень дорогими. В нашей стране производятся генно-инженерный интерферон (реоферон), инсулин, интерлейкин-2, вакцина против гепатита В.

Генная инженерия и биотехнология открывают перед человечеством огромные перспективы. Однако даже обычные эксперименты в этой области могут быть опасными, так как при переносе генов могут возникнуть организмы с непредсказуемыми свойствами, поэтому работы по генной инженерии производятся в соответствии со строгими международными правилами.

Глава 6

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

6.1. Изучение микроорганизмов в окрашенном и живом состояниях

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопов (от греч. «микрос» – малый и «скойпен» – рассматривать, наблюдать).

Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используется несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальных методов микроскопии (темнопольный, фазовоконтрастный).

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул) и степень чистоты выделяемой культуры.

Приготовление окрашенного препарата включает в себя несколько последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Вначале обезжиривают предметное стекло и наносят на него каплю изучаемой взвеси микроорганизма. Если мазок получают из бактерий, выросших на плотной питательной среде, то предварительно на стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют материал (рис. 23, см. цв. вклейку).

После высушивания мазка на воздухе необходима фиксация. Для этого стекло помещают в сосуд с этанолом или ацетоном (химический способ фиксации) или трижды проводят в пламени спиртовки (физический способ фиксации). Этим достигаются сразу две цели – микроорганизмы погибают и плотно фиксируются на поверхности стекла.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простых методах можно использовать только одну краску – водный фуксин (1 – 2 мин) или метиленовый синий (3 – 5 мин). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре, или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям. Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в таких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истинную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде колебаний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что затрудняет наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метилцеллюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.

6.2. Культивирование микроорганизмов на питательных средах

В природе микроорганизмы существуют в смешанной популяции. Для изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения необходимо прежде всего изолировать отдельные виды микробов и вырастить их в виде так называемых «чистых культур», а затем идентифицировать, т. е. установить их соответствие видам, описанным в специальных определителях (схема).

Культивировать микроорганизмы можно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть простерилизованы и после посева инокулята (микробного материала), защищены от загрязнения извне с помощью пробок или металлических колпачков и крышек.

Посев инокулята является первым этапом исследования. В практической работе для получения «чистых культур» микроорганизмов используют одну из модификаций метода высева на чашки со средой.

Схема

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Рис. 25. Посев штрихами

Эти методы основаны на том, что отдельные микроорганизмы развиваются на поверхности либо в глубине питательной среды, в которую добавлен агар или какое-нибудь другое гелеобразующее вещество.

Петлю стерилизуют в пламени, остужают и вносят в пробирку с исследуемым материалом. Затем снимают или приоткрывают крышку чашки Петри с питательной средой (рис. 24, см. цв. вклейку) и вносят материал одним из нижеперечисленных способов.

1. Посев петлей: посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки, избыток снимают, проколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по стерильной поверхности среды (рис. 25).

2. Посев шпателем: материал наносят на поверхность среды петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности агара. После посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.

3. Посев тампоном: тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

4. Посев на секторы: дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не переходили на другой (рис. 26).

5. Посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкой бульонной культуры или взвеси микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой и тщательно распределяют по всей поверхности среды. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

Рис. 26. Посев секторами

После посева чашки закрывают и переворачивают вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках – в верхней части. При выделении чистых культур аэробов можно использовать методы, основанные не только на механическом разобщении бактерий, но и на их различиях по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов. Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавляя полиеновые антибиотики (нистатин) в среду, очищают бактериальные культуры, сильно загрязненные грибами.

Посевы инкубируются в термостате 18 – 24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.

Второй этап исследования – изучение изолированных колоний. Колония – это изолированное скопление микробных клеток одного вида на плотной питательной среде. Строение колоний является важным культуральным признаком при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на определенной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии.

Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. В проходящем свете их рассматривают со стороны дна чашки; отмечают величину колоний (крупные – от 4 – 5 мм в диаметре и более; средние – 2 – 4 мм; мелкие – 1 – 2 мм и карликовые – меньше 1 мм), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность (рис. 27).

В отраженном свете, рассматривая колонии со стороны крышки, определяют цвет (бесцветная, окрашенная), характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), расположение колоний на поверхности среды (выпуклое, плоское, вдавленное).

Обращают внимание на характер краев колоний (ровные, фестончатые, зазубренные), структуру (гомогенная, зернистая, однородная или различная в центре и по периферии).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры: а) гладкие – S-тип (от англ. smooth – гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией; б) шероховатые – R-тип (от англ. rough – шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Рис. 27. Формы колоний микроорганизмов (по: Шильникова В. К., 2004): а – круглые; б – круглые с фестончатым краем; в – круглые с валиком по краю; г и д – ризоидные; е – с ризоидным краем; ж – амебовидные; з – нитевидные; и – складчатые; к – неправильные; л – концентрические; м – сложные

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus – слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окрашивают и микроскопируют. При подтверждении однородности состава колонии микроскопированием оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов. При составлении искусственных питательных сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для жизни, так и физико-химические условия, в которых они могут осуществлять обмен между клеткой и средой.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов питательные среды должны соответствовать следующим требованиям:

1. Они должны содержать все элементы, из которых строится клетка: макроэлементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, ванадий, хлор, натрий, кремний и др.). Все элементы должны находиться в удобоусвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. Источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения – соли фосфорной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с органическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.

2. Питательная среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды).

3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, т. е. соответствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микроорганизмов – 0,5 %; галофильных – 3 %).

4. Концентрация водородных ионов (рН) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон рН 4,5 – 8,5).

5. Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) среды должен соответствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов 0,120 – 0,060 В, для аэробов – более 0,080 В.