Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус

* Включая мутации S466X и S466X-R1070Q

Приведенные в Таблице 1 данные дают общее и несколько смещенное представление о разнообразии и частоте мутаций у российских пациентов с МВ, что связано с рядом особенностей проведения тестирования:

• ДНК-тестирование не является обязательным этапом при диагностике МВ, в том числе и в ходе неонатального скрининга в России, и выполняется по желанию родителей ребенка. Поэтому во многих регионах обследованы не все больные с установленным диагнозом;

• ДНК-тестирование большей части пациентов выполнялось на панелях, включающих ограниченный спектр мутаций (от 11–16 до 30 мутаций);

• в ряде случаев у пациентов с МВ не удается обнаружить двух мутаций, что может быть связано с их отсутствием в стандартных тест-системах, несовершенством алгоритмов ДНК-тестирования, существованием неизвестных ранее генетических вариантов, атипичных случаев МВ или МВ-подобных состояний, связанных с нарушением работы иных генов.

На основании сведений об эпидемиологической генетике МВ можно сделать следующие предположения:

• частота и спектр мутаций, ассоциированных с развитием МВ, варьируются в зависимости от региона проживания и этнической принадлежности обследуемых пациентов с МВ;

• отсутствуют репрезентативные сведения о спектре и частотах мутаций в гене CFTR для всей российской популяции и ряда регионов;

• для расчета вклада отдельных мутаций и их связи с развитием заболевания необходимо продолжить работу по созданию общероссийского регистра пациентов с МВ с внесением в него информации о результатах молекулярно-генетического тестирования всех диагностированных пациентов вне зависимости от формы проявления, возраста манифестации и региона проживания.

3.8. Этнические особенности спектра мутаций в гене CFTR у российских больных МВ

Спектр и относительные частоты мутаций гена CFTR могут существенно варьироваться не только в разных обследуемых регионах, но и в разных этнических группах. В регионах с преобладающим русским населением наиболее частыми являются мутации F508del (50-55%), CFTRdele2,3 (3,5-8,3%), 2143delT (1,1-3,8%), 2184insA (1,5-2,5%). Наименьшее значение относительной частоты мутации F508del отмечено в Северо-Кавказском ФО – 28,57%, но здесь высокую долю составляют мутации 1677delTA (18,75%), W1282X (16,07%) и E92K (2,68%). Мутация 1677delTA распространена среди автохтонных народов Кавказского региона. Так, у чеченских пациентов с МВ (34 индивида) ее доля составляет 66,2%, высока также доля мутации E92K (14,7%).

В недавно проведенной работе, в рамках которой исследованы больные МВ из Республики Чувашия [35], показано, что превалирующей по частоте мутацией у чувашских пациентов является мутация E92K, ранее обнаруживаемая в странах юго-восточного Средиземноморья, в частности в Турции [26, 36]. Мутация E92K обнаружена на 55,6% мутантных хромосом (20/36) у 18 обследованных чувашских пациентов, тогда как относительная доля мутации F508del составила 25% (9/36). Анализ здоровых индивидов показал, что гетерозиготным носителем мутации E92K является каждый 68-й житель Чувашии (5/343, т.е. 1:68), а мутации F508del – каждый 86-й [35]. Мутация E92K встречается у пациентов из разных популяций Волго-Уральского региона (Чувашия – 53,19%, Удмуртия – 6,76%, Татарстан – 2,38%, Башкирия – 1,37%, Самарская область – 3,06%, Пермский край – 0,75%, Оренбургская область – 1,96%), в Ханты-Мансийском АО (3,85%), а также во многих других регионах РФ [34]. Высокая доля мутации E92K у чувашей, вероятно, объясняется эффектом основателя и прохождением популяции чувашей через «бутылочное горлышко» в XIV веке.

Мутация W1282X встречается в разных регионах мира. Предполагают, что мутация W1282X произошла в результате единичного мутационного события в популяции ближневосточных евреев до их переселения в Европу. Наибольшей величины ее частота достигает в популяции евреев-ашкенази Израиля (до 50% мутантных аллелей у больных с МВ). Распространение мутации W1282X в других регионах Европы и мира связывают с расселением евреев-ашкенази. Относительно высокая доля этой мутации наблюдается в регионах с высоким уровнем урбанистического населения. Аналогичную тенденцию можно наблюдать и в России: в Москве – 2,93%, Смоленске – 2,94%, Новосибирске – 2,56%, Кемеровской области – 2,17% [34]. Интересным фактом является недавно обнаруженная высокая доля мутации W1282X у больных МВ карачаевцев (18 из 20 аллелей, 90%). Частота мутации W1282X в выборке здоровых карачаевцев из Карачаево-Черкесии составила 1,8% (6/660 хромосом). Проникновение мутации W1282X на Восточный Кавказ можно связать с миграцией евреев из Византии через северное Причерноморье или Грузию в раннем средневековье, или через Персию, или Иран в позднем средневековье. Высокую долю мутации W1282X в этой популяции можно объяснить эффектом основателя [37]. Кроме «урбанистической» привязанности также очевиден вектор распространения мутации W1282X с юга на север – с максимальной концентрацией в кавказских республиках (в частности, в Карачаево-Черкесии) и минимальной встречаемостью в регионах севернее Москвы.

Мутацию 394delTT называют «нордической» («северной»): она распространена с высокой частотой в странах, расположенных по побережью Балтийского моря и вдоль связанных с ним речных путей (в Швеции, Норвегии, Дании, Финляндии, Эстонии, России и т.д.). В России эта мутация обнаружена также в регионах проживания тюркоязычных народов, в этногенезе которых прослеживается угро-финский элемент (Татарстан – 1,59%, Башкирия – 1,37%, Нижегородская обл. – 1,41%, Оренбургская обл. – 1,96%, Самарская обл. – 1,02%) [34].

Мутация 1677delTA, впервые обнаруженная у грузинских пациентов [26, 38], распространена на Кавказе у людей, относящихся и к другим этническим группам: у чеченцев, ингушей, армян и др. (см. Табл. 2).

В небольшой группе пациентов из Дагестана неоднократно выявлены мутации: A96E, S1159F, R1066C, 1248+1G>A (последняя мутация также однократно встретилась у осетина).

Таблица 2. Спектр мутаций в гене CFTR в этнических группах российских больных муковисцидозом

1 – [34]; 2 – [35]

В НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ (г. Томск), систематически проводится анализ спектра мутаций гена CFTR у больных МВ из Сибирского региона (среди обследованных пациентов преобладают русские). Помимо основного, наиболее частого, генного дефекта F508del, следующие мутации выявляются с частотой >4%: CFTRdele2,3, E92K, 2184insA, R1066C; с частотой >2%: G542X, 3849+10kbC>T, R1162X, 2143delT, L138ins, E217G и функционально значимый вариант 5T (IVS8-5T); с частотой ~1%: 2184delA, 394delTT, W1282X, N1303K, R347P, R553X, 3821delT, R117C, Y569C, 3791delC, 2789+5G>A, L1335P, 4015delA, 4040delA, W1310X, R1158X, 1898+1G>C, 1898+1G>A, 1898+2T>C, S1196X, G228R, Q98R, 3944delGT, I148T, 4382delA и крупные внутригенные делеции/ дупликации. Охарактеризованы мутации у представителей коренных народностей Сибири (буряты, хакасы, тувинцы, алтайцы). Спектр определенных у них мутаций: F508del, c.650A>G (E217G), R1066C, R1162X, c.293A>G (Q98R), c.682G>C (G228R); две последние – новые мутации [39].

3.9. Подход к генетическому тестированию

По рекомендациям Европейского консенсуса по МВ [2], для обеспечения высокой эффективности диагностический метод должен обеспечивать выявление по крайней мере одной клинически значимой мутации в гене CFTR не менее чем у 90% больных МВ. При ДНК-диагностике необходимо обеспечивать качественное и достоверное обнаружение генетических вариантов в исследуемой популяции/регионе. Использование в ходе тестирования ограниченного набора мутаций может привести к возникновению ряда проблем, связанных с невысокой диагностической чувствительностью такого подхода в генетически гетерогенных популяциях, и необходимости разработки специфических диагностических панелей, включающих расширенный спектр мутаций.

Для обеспечения достоверности результатов проводимых исследований следует разработать алгоритм и стандарты проведения молекулярно-генетического тестирования и использовать лишь те диагностические методы и наборы реагентов, которые прошли необходимые клинические испытания и имеют подтвержденные в рамках тестирования на достоверной выборке образцов из российской популяции диагностические и аналитические характеристики.

Также необходимо отметить важность создания и ведения регистра пациентов с МВ с обязательным внесением в него информации об определенном генотипе в целях разработки более оптимальных диагностических панелей для конкретных регионов.

3.9.1. Панели мутаций гена CFTR, используемые в Российской Федерации

1. CFTRdele2,3, G85E, 394delTT, R117H, E92K, A96E, L138ins, 604insA, 621+1G>T, R334W, R347P, S466X (TGA), I507del, F508del, 1677delTA, 1717-1G>A,G542X, G551D, R553X, 2143delT, 2183AA>G, 2184insA, 2789+5G>A, 3272-16T>A, S1159P(F), S1196X, 3667insTCAA, 3821delT, 3849+10kbC>T, W1282X, W1282R, 3944delGT, N1303K – лаборатория генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ» (www.med-gen.ru) [35, 36, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46].

2. F508del, I507del, 1677delTA, CFTRdele2,3, E92K, 3849+10kbC>T, R334W, R347P, G551D, R553X, G542X, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 306delTAGA, 3821delT, L138ins, N1303K, W1282X, 3944delGT, 2176insC, 2183delAA, 2183AA>G и коммерческий набор «Elucigene CFEU2v1» (фирма Gen-Probe, США) на 50 частых европейских мутаций – НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ (www. medgenetics.ru) [39].

3. CFTRdele2,3, G85E, 394delTT, R117H, E92K, E92X, L138ins, 621+1G>T, R334W, R347P, S466X, I507del, F508del, 1677delTA, 1898+1G>C, G542X, G551D, R553X, L581X, 2143delT, 2183delAA, 2183AA>G, 2184insA, S945L, R1066C, S1159P, R1162L, L1335P, R1162X, S1196X, 3849+10kbC>T, W1282X, W1282R, N1303K – НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, СПб. [48].

4. CFTRdele2,3, F508del, I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbC>T, 604insA, 3944delGT, S1196X, 621+1G>T, E92K, 327226A>G, 4015delA, 4022insT, W1282R, 2785+5G>A, 3272-16T>A, S466X, 1898+1G>A, 3120+1G>A, R347P, S945L – компания «Центр молекулярной генетики» (http://www.dnalab.ru/ diseasesdiagnostics/cysticfibrosis).

5. F508del, CFTRdele2,3, E92K, 3849+10kbC>T, 2184insA, W1282X, 2143delT, N1303K, G542X, 1677delTA, L138ins, R334W, 394delTT, 3821delT, 2789+5G>A, S466X, S1196X, 3272-16T>A, W1282R, 3944delGT, 3849G>A, 712-1G>T, 621+1G>T, R553X, 367del5, 4015delA, G85E, W1310X, S1159P, R347P, CFTRdup 6b-10, S945L, R1066C, 1898+1G>A, R1162X, S1159F, L1335P, R785X, R117H, 4428insGA, D1152H, 604insA, 624delT,I506T, A96E,3859delC,1716+1G>A, 3272-26A>G, G551D, 2183AA>G – лаборатория молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России, г. Москва.

Качество и достоверность результатов молекулярно-генетического тестирования в значительной степени зависят от комплекса факторов:

• наличия стандартов и контрольных образцов для проверки качества исследования в лаборатории;

• спектра тестируемых генетических нарушений гена CFTR;

• метода, используемого для проведения исследования;

• диагностических характеристик используемой панели мутаций в гене CFTR для популяции, в которой проводится исследование;

• квалификации специалиста, выполняющего лабораторную часть исследования;

• квалификации специалиста, выполняющего интерпретацию и трансляцию результатов тестирования;

• наличия внешнего контроля качества исследования;

• использования стандартного и однозначного алгоритма ДНК-тестирования в общей схеме диагностики МВ.

3.9.2. Стратегия молекулярной диагностики МВ

Согласно выработанным Консенсусом по МВ рекомендациям [2], стратегия молекулярной диагностики МВ включает несколько этапов.

На первом этапе проводится поиск мутаций, наиболее частых в популяции, к которой принадлежит обследуемый. Для многих стран Европы и Америки определены специфичные панели, обычно включающие 25-35 мутаций, позволяющие выявить до 75-90% всех мутантных аллелей гена CFTR. Применяемые в России панели представлены в Разделе «Панели мутаций гена CFTR, используемые в Российской Федерации».

На втором этапе проводят расширенный поиск более редких мутаций, используя секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование генома (MPS/NGS).

В ФГБНУ «МГНЦ» (Москва), НИИ медицинской генетики, НИМЦ (Томск), НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (Санкт-Петербург) и в ООО «Центр молекулярной генетики» (Москва) на втором этапе используют метод секвенирования по Сэнгеру для выявления мутаций в гене CFTR у пациентов, у которых на первом этапе не были идентифицированы одна, либо обе мутации. Компанией «Парсек Лаб» (Санкт-Петербург) (www.parseq.pro) разработан метод диагностики мутаций гена CFTR на основе высокопроизводительного секвенирования нового поколения. В автоматическом режиме выявляются 319 мутаций, ответственных за развитие клинически значимых проявлений МВ, а также широкий спектр мутаций с неподтвержденным/неизвестным клиническим эффектом (включая мутации de novo). Метод позволяет также обнаруживать крупные делеции/ дупликации гена. Все выявленные методом NGS патогенные варианты гена CFTR подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру [47].

В лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ «НЦЗД» Минздрава России проводится диагностика методом NGS с использованием технологии таргетного обогащения всех кодирующих, прилегающих интронных, а также 3?- и 5?-нетранслируемых областей гена CFTR. Все выявленные на этом этапе патогенные варианты гена CFTR также подтверждаются методом секвенирования по Сэнгеру.

Третий этап. Обычными сканирующими методами, в том числе секвенированием, можно выявить нарушения последовательности гена, незначительные по протяженности: нуклеотидные замены, небольшие делеции/инсерции. Перестройки, охватывающие несколько экзонов/интронов, такими методами не выявляются. Это можно сделать, используя следующие технологии: MLPA – мультиплексную лигазную зондовую амплификацию либо QFMP – количественную флуоресцентную мультиплексную ПЦР.

К настоящему времени у российских пациентов с МВ выявлены несколько протяженных делеций: CFTRdeleprom.-10, CFTRdele2-8, CFTRdele5-6a, CFTRdele5-10, CFTRdele12-13,16, у нескольких пациентов выявлены делеция CFTRdele6b-10, а также протяженные дупликации: CFTRdup6b-10, CFTRdup23,24, CFTRdupprom-10. Следует учитывать, что, согласно данным Европейского консенсуса по МВ, проведение расширенного молекулярного исследования гена CFTR позволяет выявить мутацию в 98%. Результаты поиска мутаций в гене CFTR у российских пациентов, проведенного в соответствии с представленной стратегией, согласуются с данными Европейского консенсуса [41]. И все-таки остается небольшое число пациентов, у которых одна или даже обе мутации не идентифицированы. Это может быть связано либо с тем, что использованные методы не позволили проанализировать регионы гена, где располагаются мутации, либо с явлением однородительской дисомии, либо с фенокопиями МВ. В таких случаях при проведении сегрегационного анализа сцепленных с геном CFTR ДНК-маркеров можно определить статус носительства определенных гаплотипов членами обследуемой семьи и подтвердить или опровергнуть обусловленность заболевания нарушениями в гене CFTR. Так, выявлены две семьи из Германии, в которых дети с МВ унаследовали от родителей оба гена CFTR, так же как и их здоровые сибсы; а также две семьи из США, где больные сибсы различались по обеим родительским копиям гена CFTR [2].

3.10. Пренатальная диагностика МВ. Организация пренатальной диагностики МВ в России

Особого внимания заслуживает пренатальная диагностика (ПД) МВ в семьях высокого риска. Отличительной чертой молекулярной диагностики является ее универсальность. Это означает, что диагностика может проводиться на любой стадии онтогенеза, в том числе до рождения, и материалом для ДНК-анализа могут быть любые клетки и ткани плода.

Благодаря успехам медицины зародыш человека доступен для исследований, а значит, и для диагностики практически на любой стадии развития. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, инструментальной и методической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией акушера-оператора. Для забора плодного материала обычно используют один из трех основных методов. К таковым относятся трансабдоминальная аспирация ворсин хориона/плаценты, амниоцентез или кордоцентез. Образцы ДНК выделяют из биоптатов хориона (плаценты), клеток амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови плода. При необходимости для молекулярного анализа можно использовать соскоб клеток с цитологических препаратов, ранее использованных для кариотипирования зародыша. Принимая во внимание высокую точность методов молекулярной диагностики, их большую чувствительность, необходимо помнить, что ее эффективность в значительной мере предопределена соблюдением следующих основных правил:

1. Необходимость точного клинического диагноза у пробанда