Муковисцидоз: определение, диагностические критерии, терапия. Национальный консенсус

Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы

Среди возбудителей хронической инфекции легких у больных МВ значимое место занимают НФМО, общими признаками которых являются природная устойчивость ко многим антибиотикам, высокая резистентность к дезинфектантам и распространение в больничных стационарах от больного к больному [10]. НФМО, наиболее часто вызывающие инфекции, принадлежат к нескольким родам и условно могут быть разделены на оксидазоположительные – роды Pseudomonas (кроме видов P. luteola и P. oryzihabitans), Burkholderia, Moraxella, Chryseobacterium – и оксидазоотрицательные – роды Stenotrophomonas, Acinetobacter, Bordetella (кроме B. pertussis, B. avium, B. bronchiseptica, B. hinzii) [11-13].

Большинство из упомянутых выше родов и видов НФМО обладают высокой степенью фенотипического и генотипического родства с бактериями рода Pseudomonas, и многие из них еще в 90-х гг. прошлого века относились к данному роду. Все эти микроорганизмы могут быть выделены из окружающей среды, однако клинической значимостью характеризуются только отдельные виды некоторых родов.

Pseudomonas aeruginosa

Первоначальная классификация рода Pseudomonas, состоящего из пяти соответствующих rRNA-групп, подверглась радикальному пересмотру, закончившемуся изменением классификации многих видов рода Pseudomonas и объединением в отдельные роды. Эти роды включают Burkholderia, Stenotrophomonas, Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax и Brevundimonas. Род Pseudomonas (sensu stricto) включает соответствующую rRNA-группу 1 и объединяет 11 видов: Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. veronii, P. monteilii, P. stutzeri, P. mendocina, P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. luteola, P. oryzihabitans.

Псевдомонады являются аэробными неспорообразующими грамотрицательными палочками, которые могут быть прямыми или слегка изогнутыми. Они имеют от 1,5 до 5 мкм в длину и от 0,5 до 1,0 мкм в ширину и обладают строгим дыхательным метаболизмом с использованием кислорода как конечного акцептора электронов. Некоторые изоляты могут расти в анаэробных условиях с использованием нитратов или аргинина в качестве конечных акцепторов электронов. Псевдомонады подвижны благодаря присутствию одной или более полярных флагелл. Клинические изоляты являются оксидазоположительными (за исключением P. luteola, P. oryzihabitans) и каталазоположительными, а также растут на агаре МакКонки как лактозонегативные колонии [12].

Псевдомонады широко распространены в природе с преимущественным обитанием в окружающей среде, связанной с водой. Они обнаружены в воде, почве, на растениях, включая овощи и фрукты. Ввиду способности выживать в водной среде эти микроорганизмы, особенно P. aeruginosa, стали одной из основных проблем в качестве возбудителей госпитальных инфекций [12]. Бактерии P. aeruginosa являются ведущей причиной нозокомиальных инфекций дыхательного тракта. Особое значение имеют для больных МВ. Основную роль в патогенезе инфекции легких у больных МВ играют мукоидный фенотип P. aeruginosa и воспалительные реакции больного [1, 9, 14].

Бактерии Burkholderia cepacia complex (Bcc)

Бактерии Bcc – это группа грамотрицательных, неспоробразующих бактерий. В мазках, окрашенных по Граму, эти микроорганизмы представляют собой полиморфные прямые грамотрицательные палочки размером 0,5-1,0 х 1,5-5 мкм. После культивирования на 5% кровяном агаре при t = 30 °C в течение 48 ч бактерии Bcc образуют серые гладкие колонии с ровными краями размером 1-2 мм с резким характерным запахом гнили. При наличии пигмента колонии могут быть окрашены в желтый цвет различной интенсивности. Вокруг колоний могут образовываться зоны гемолиза. На средах Эндо и МакКонки колонии Bcc размером 1 мм окрашены в светло-розовый цвет (лактозонегативные).

В настоящее время вид B. cepacia sensu lato включает 20 близкородственных геномоваров.

Таблица 1. Представители Burkholderia cepacia complex

Все геномовары могут выделяться от больных МВ, однако преобладающим является геномовар III – B. cenocepacia, обнаруженный в 70% случаев инфекции, вызванной Bcc, в Англии, Бельгии, США, Канаде [15].

В России от больных МВ, а также при исследовании образцов от больных с пневмонией в отделениях интенсивной терапии различных клиник города Москвы также были выявлены бактерии Bcc, преимущественно принадлежащие к геномовару IIIA – B. cenocepacia [14, 16].

Клиническое значение бактерий Bcc и патогенез вызванной ими инфекции

О колонизации легких Bcc у больных МВ впервые сообщено в начале 1970-х гг. [38]. Приблизительно у 20% больных, колонизированных Bcc, возникал так называемый «сепация-синдром», характеризующийся некротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией, увеличением СОЭ и лейкоцитозом, который приводил к быстрому летальному исходу. Было высказано предположение, что появление Bcc является основной причиной неблагоприятного исхода у больных МВ. В настоящее время установлено, что Bcc представляет особую опасность для больных МВ. Хроническая микробная колонизация дыхательных путей ведет к развитию легочной инфекции – основной причины прогрессирования бронхолегочного процесса и смертности у больных МВ. Установлено, что особенностью инфекции при МВ является персистенция ассоциаций микроорганизмов в 59,4% случаев. Особенностью персистенции штаммов Bcc является тяжелое течение в виде смешанной инфекции в ассоциации с бактериями P. aeruginоsa. Бактерии Bcc, способные персистировать у больных МВ, характеризуются устойчивостью ко многим антибиотикам. Доказана длительная (до 1 года 5 мес) персистенция штаммов Bcc, выделенных от одного больного, с помощью мониторинга микрофлоры НДП. Штаммы Bcc, колонизируя НДП больных МВ, способны длительно персистировать и передаваться от пациента к пациенту [3, 17, 18].

Другие, более редко встречающиеся возбудители хронической респираторной инфекции –

Achromobacter xylosoxidans и Achromobacter ruhlandii

Род Achromobacter в настоящее время включает 15 видов и 7 генетических групп.

А. xylosoxidans, A. ruhlandii – оппортунистические патогены, оксидазо- и каталазоположительные грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы. Обладают природной резистентностью ко многим антибиотикам.

В последнее время хроническая инфекция, вызванная Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter ruhlandii, у больных МВ встречается часто. Согласно полученным данным, третьим по частоте встречаемости из НФМО является Achromobacter xylosoxidans. Он и Achromobacter ruhlandii при исследовании образцов от больных детей за 2012-2013 гг. выделялись в 9% случаев [14].

Род Acinetobacter

Номенклатура видов Acinetobacter находится в процессе развития. В настоящее время получили наименование 7 видов. Для рутинных клинических целей в номенклатуре достигнут компромисс, и организмы обозначаются как комплекс Acinetobacter calcoaceticus-baumannii. Большинство клинических лабораторий могут дифференцировать биовар anitratus от биовара lwofii на основе окисления глюкозы (anitratis) или неокисления последней (lwofii).

Подобно P. aeruginosa, бактерии рода Acinetobacter распространены в окружающей среде. У 25% здорового населения этим микроорганизмом колонизированы кожные покровы, а у 7% колонизирована глотка.

Виды Acinetobacter чаще всего вызывают внутрибольничную пневмонию. В больничном учреждении факторами риска для возникновения внутрибольничной пневмонии являются интубация, лечение антибиотиками, пребывание в палатах интенсивной терапии. Описан ряд инфекций, связанных с использованием медицинских приборов, например нозокомиальные менингиты. Чаще всего пневмонии как внутрибольничные инфекции возникали у больных раком и с травмами, а у ожоговых больных возникала раневая инфекция [10].

Stenotrophomonas maltophilia

Этот микроорганизм, ранее обозначавшийся как Pseudomonas maltophilia (до 1988 г.), позднее – Xanthomonas maltophilia (1995-1997 гг.), является распространенным комменсалом, легко выделяемым из воды, почвы и сточных вод. Значимость этого микроорганизма при выделении не всегда ясна и может зависеть от наличия факторов риска. Так, в одном исследовании, проведенном в общем госпитале в 1979 г., показано, что только 6 (4,6%) из 128 изолятов оказались клинически значимыми, то есть вызывали внутрибольничную инфекцию (ВБИ). С другой стороны, исследования в онкологическом центре показали, что ВБИ вызывали 114 (48%) из 237 изолятов. S. maltophilia наиболее часто связана с пневмонией, особенно у больных с МВ, но может также вызывать широкий круг других ВБИ. Наибольшее число инфекций встречается в больничных учреждениях, где факторы риска включают злокачественные опухоли, использование центральных венозных катетеров и лечение антибиотиками. В исследовании 91 случая бактериемий, вызванных S. maltophilia, у 78% больных были злокачественные опухоли, а источником инфекции был центральный венозный катетер. Показатель смертности от ВБИ в данном исследовании составил 38%.

Недавно описано несколько необычных проявлений инфекции, вызванной S. maltophilia. Так, в сообщении о 114 инфекциях из онкологического центра говорится, что у 17 больных наблюдали инфекции слизистой оболочки и кожных покровов и/или инфекции мягкой ткани, 6 имели метастатические целлюлиты, представлявшие собой кожные узлы с окружающими целлюлитами, и один – повреждение в виде гангренозной эктимы.

Каждый из рассматриваемых НФМО способен вызывать развитие хронической пневмонии у больных с МВ, исход которой, как правило, неблагоприятен для больного [10].

Микобактерии, не принадлежащие к виду Mycobacterium tuberculosis

В последние годы возросло количество случаев инфицирования больных МВ микобактериями, не относящимися к виду M. tuberculosis (Nontuberculous mycobacteria (NTM)). Из мокроты пациентов выделяли Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), Mycobacterium chelonei, Mycobacterium fortuitum [19]. Среди пациентов с муковисцидозом в США бактерии NTM идентифицировали в 12,5% случаев, причем наиболее часто выделяли Mycobacterium avium complex (MAC). На втором месте по частоте высева были Mycobacterium abscessus [20]. Особенностью культивирования микобактерий является длительный период роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. Кроме того, у больных МВ образцы мокроты контаминированы P. aeruginosa и другими микроорганизмами. Рекомендуется обрабатывать образцы мокроты от больных МВ для устранения контаминации перед посевом 0,25% N-ацетил-L-цистеином и 1% гидроксидом натрия (NALC-NaOH), а затем добавлять 5% oxalic acid (OXA). Особое значение для идентификации и типирования этих микроорганизмов имеют молекулярно-генетические методы (ПЦР, мультилокусное секвенирование, секвенирование генома). Для точной постановки диагноза необходимы выделение культуры микобактерий и дальнейшее генетическое типирование [21].

Анаэробные микроорганизмы

Использование анаэробных культуральных методик указывает на обнаружение в дыхательных путях больных МВ большого числа анаэробов [14, 22]. В исследовании Tunney и cоавт. анаэробные бактерии, прежде всего Prevotella, Veillonella, Propionibacterium и Actinomyces, были изолированы в 64% образцов мокроты у пациентов с МВ. Колонизация P. aeruginosa достоверно повышает вероятность присутствия анаэробов в мокроте. Сходные анаэробные штаммы были обнаружены в бронхоальвеолярной жидкости у детей с МВ. В двух исследованиях показано, что микроорганизмы из рода Prevotella особенно часто встречаются у больных МВ [22]. Более того, высказывается предположение об их провоспалительном действии, что подтверждается резким увеличением концентрации данных микроорганизмов в период обострения. Тем не менее точно определить клиническое значение этих бактерий на сегодня не представляется возможным.

4.2. Алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции

Идентификация возбудителей хронической респираторной инфекции является важнейшим звеном в прогнозе для жизни больного МВ. В связи с этим в настоящее время в лабораторной диагностике используются современные микробиологические, молекулярно-генетические и молекулярно-биологические методы.

Правильная микробиологическая диагностика мокроты больных МВ затруднительна, так как микробная флора дыхательных путей у таких больных представлена часто ассоциациями, а некоторые микроорганизмы проявляют атипичные для своего вида фенотипические свойства, например ауксотрофные P. aeruginosa и SCV (small colony variants – фенотип мелких колоний) S. aureus. Разработанный алгоритм микробиологической диагностики хронической респираторной инфекции включает несколько этапов, позволяющих рационально и максимально достоверно провести диагностику смешанной хронической инфекции легких.

Материалом при исследовании НДП у больных МВ являются мокрота при кашле, мазок из зева после кашля, ларингеальный или назофарингеальный аспират, индуцированная гипертоническим раствором мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, материал щеточной биопсии при бронхоскопии. По данным Equi et al., чувствительность и специфичность результатов посевов мазка из зева после кашля по сравнению с результатами посевов спонтанной мокроты составляют 34 и 100% соответственно. Чувствительность показывает процент положительного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с положительным результатом, полученным при посеве мокроты. Специфичность показывает процент отрицательного результата, полученного методом посева мазка из зева, по сравнению с отрицательным результатом, полученным при посеве мокроты [14]. Установлено, что любая задержка, в частности хранение при комнатной температуре (20-25 °C), приводит к увеличению количества быстро растущих бактерий, что может привести к угнетению роста истинных патогенов, и, наоборот, хранение в холодильнике (4 °C) может привести к гибели термофильных патогенных микроорганизмов.

Перед посевом мокроту предварительно отмывают в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и гомогенизируют механическим (перемешивание в течение 10 мин стерильными микробиологическими бусами) или химическим (обработка дитиотреитолом) методом.

Обязательным для установления диагноза хронической инфекции, вызванной ассоциацией возбудителей, является неоднократное в течение 6 месяцев выделение чистой культуры микроорганизмов – так называемый «золотой стандарт». Поэтому посев мокроты осуществляют на универсальные среды – 5% кровяной и шоколадный агары с накладыванием на поверхность дисков с гентамицином и оптохином для выявления Haemophilus influenzaе и Streptococcus pneumoniaе и селективные среды для выделения S. aureus, P. aeruginosa, Bcc, Candida spp., Enterobacteriacеае и НФМО (ЖСА, цетримидный агар, BCSA, Сабуро, Эндо).

Идентификацию основных возбудителей хронической инфекции проводят следующим образом:

Идентификация золотистого стафилококка

Идентификацию стафилококков проводят на селективной среде – желточно-солевом агаре (ЖСА). На основании фенотипических свойств – наличия пигмента и лецитиназной активности штаммы стафилококков относят к виду S. аureus. Для подтверждения принадлежности стафилококка к виду S. аureus также необходимо использовать тест на коагулазу. Летициназоположительные стафилококки, характеризующиеся положительным тестом на коагулазу, относят к виду S. аureus.

У больных МВ встречаются атипичные формы золотистого стафилококка, которые трудно выделять и идентифицировать общепринятыми методами ввиду их замедленного роста и нетипичных для стафилококков свойств. Такие атипичные формы называют штаммами с фенотипом мелких колоний (small-colony variant (SCV)). Бактерии медленно растут, в результате через 48 ч роста формируются очень маленькие, без пигмента и гемолиза колонии, имеющие fried-egg-фенотип («яичницы-глазуньи») или точечный фенотип, редко – мукоидный фенотип. SCV-стафилококки имеют также другие атипичные, не свойственные метаболически нормальным стафилококкам свойства. Могут быть лецитиназоотрицательными, слабо коагулазоположительными, характеризоваться отсутствием фермента маннитола, ауксотрофными по гемину, тимидину и менадиону и характеризоваться возможностью возврата в родительскую форму. Часто ассоциируются с персистентной инфекцией и обладают резистентностью к антибиотикам [10].

По данным Gоmez-Gonzаlez et al., распространенность SCV S. aureus в клинических экземплярах составляет приблизительно 1%, а среди больных МВ – до 17%. SCV S. aureus может часто высеваться от пациентов, которые получали гентамицин или другие аминогликозиды [11].

Лабораторная диагностика, определение чувствительности к антибиотикам атипичных форм золотистого стафилококка могут иметь существенное значение для выбора тактики антимикробной терапии стафилококковой инфекции у больных МВ.

В результате проведенных исследований было выявлено 12 штаммов SCV [14]. При этом в 6 случаях наблюдали смешанную инфекцию с P. aeruginosa. Четыре из выделенных штаммов были резистентными более чем к трем группам антибиотиков, у двух из которых выявлен ген MecA. Поэтому при выделении штаммов с SCV-фенотипом необходимо подтвердить принадлежность к виду S. aureus с использованием молекулярно-генетических методов (ПЦР, MLST) и исследовать их на антибиотикочувствительность.

При исследовании антибиотикочувствительности 208 штаммов стафилококков диско-диффузионным методом или с помощью ATB-стрипов (BioMerieux) было показано [14], что 31 (15%) штамм устойчив к оксациллину. 15 из этих штаммов были коагулазоположительными, что позволило, учитывая также пигментообразование и лецитиназную активность, отнести их к MRSA, а остальные 16 штаммов – к метициллин-резистентным коагулазоотрицательным стафилококкам (КОС).

Для определения устойчивости стафилококков к метициллину обычно используют диско-диффузионный метод [23]. Применяют диски с оксациллином (1 мкг), так как оксациллин является наиболее стабильным антибиотиком при хранении. Идентификацию осуществляют в условиях, способствующих экспрессии устойчивости, а именно на среде Мюллера-Хинтона с добавлением 4% NaCl, инкубируя чашки Петри в течение 24 ч при 37 °С. Некоторые исследователи предлагают проводить инкубацию в течение 48 ч при 30 °С [23].

В связи с имеющейся гетерогенностью устойчивости к метициллину ряд исследователей рекомендуют проведение идентификации гена mecA молекулярно-генетическими методами с использованием ДНК-зондов или амплификацией гена в ПЦР.

При выявлении у стафилококков устойчивости к метициллину диско-диффузионным методом и идентификации гена mecA генетическими методами такие штаммы рекомендуется далее тестировать на устойчивость к ванкомицину, так как большинство VISA и гетеро-VRSA обычно устойчивы к метициллину.

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) установил, что стафилококки, у которых рост ингибируется 4 и менее mg/ml ванкомицина, являются чувствительными, 8-16 mg/ml – умеренно устойчивыми и 32 и более mg/ml – резистентными. В соответствии с этими показателями в литературе умеренно устойчивые к ванкомицину штаммы S. aureus (MIC ванкомицина = 8 mg/ml) обозначают VISA, а резистентные (MIC = 32 и более mg/ml) – VRSA.